7.Иммунологические показатели крови при применении пробиотиков

7.1. Изменение иммунологических показателей периферической крови под влиянием ветома 1.1.

При выращивании молодняка в условиях интенсивных технологий возможно снижение показателей неспецифической резистентности организма и проявление иммунодефицитов (Гюллинг и соавт., 1989; Монтиэль , 1998).

Как указывает Г.Н. Крыжановский (1985), возникновение вторичных иммунодефицитов, сопровождающихся нарушением иммунологической реактивности, чревато, прежде всего, снижением устойчивости организма животных к возбудителям вирусных и бактериальных инфекций. Устойчивость организма птиц к неблагоприятным воздействиям внешней среды определяется состоянием его защитных сил (Корень, 1969; Грошева и соавт., 2000).

Роль иммунной системы в противоинфекционной защите организма доказана. В отечественной и зарубежной научной литературе появляется все больше данных о прямой и обратной связи иммунной системы с системой интерферона, так как состояние и активность этих систем во многом определяют исход заболевания, характер его течения.

Антибиотики, широко применяемые в птицеводстве для профилактики болезней и лечения, не всегда дают желаемые результаты, так как к ним адаптируется большинство микроорганизмов, а ряд антибиотиков обладают иммуносупрессивным действием (Зудова и соавт., 2000).

Р.В. Петров и соавт. (1985), Г.А. Ноздрин (1996), Г.А. Ноздрин и соавт. (1997, 1999) сообщают, что механизм действия неспецифических иммунокорректоров существенно шире, чем принято считать, и они значительно повышают эффективность традиционной профилактики и терапии различных болезней. Поэтому применение иммунокорректоров, действие которых направлено на повышение неспецифической резистентности организма птиц, заслуживает особого внимания.

В научной литературе имеются данные об успешном применении пробиотиков для повышения резистентности организма животных и птиц (Mallik et al., 1995; Toth et al., 1987; Wren, 1987; Cox, 1988; Ewans et al., 1988; Fox, 1988; Goren et al., 1988; Панин и соавт., 1996; Ноздрин и соавт., 1997; Бовкун и соавт., 1998; Карпуть  и соавт., 2000; Литвина, 2000).

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов с заданными свойствами, полученными методами генной инженерии. Один из таких препаратов – пробиотик ветом 1.1. В его состав введена рекомбинантная бактерия Bacillus subtilis В-7092, способная нарабатывать не только антибактериальные вещества, но и человеческий альфа-2 интерферон, обеспечивающий противовирусную защиту и стимулирующий клеточный и гуморальный факторы иммунитета.

И.М. Карпуть и соавт. (1996) изучали иммунный статус цыплят-бройлеров в зависимости от содержания в инкубационных яйцах защитных факторов и заселения кишечника полезной микрофлорой. Цыплята получали энтеробифидин из бифидобактерий и препарат из лакто-, бифидо- и пропионовых бактерий. После введения препаратов в крови у цыплят увеличивалось количество лейкоцитов, особенно за счет Т-лимфоцитов. Усиливалась фагоцитарная активность макрофагов, стабилизировались уровень иммуноглобулина и гематологические показатели. Энтеробифидин и комплексный препарат из молочно-кислых бактерий при использовании их цыплятам стимулируют местную и общую защиту кишечника.

М.П. Бабина (1998) сообщает, что применение пробиотиков энтеробифидина и бактрила профилактирует у цыплят-бройлеров развитие возрастной иммунной недостаточности, усиливает местную защиту пищеварительного тракта, стимулирует рост и позволяет сократить применение противомикробных препаратов.

Обобщая литературные данные по применению пробиотиков для повышения резистентности организма животных и птиц, можно отметить, что важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, оказывать в ряде случаев противоаллергическое действие, регулировать и стимулировать факторы неспецифической резистентности организма.

Воздействие многообразных факторов внешней среды на живой организм не может не сказаться на формировании и проявлении защитных сил организма, поэтому изучение таких факторов становится важной частью научных исследований. Особое значение это приобретает в птицеводстве как одной из интенсивных отраслей промышленного животноводства.

Для изучения влияния ветома 1.1 на отдельные иммунологические показатели крови сформировали 3 опытных и контрольную группы по 55 цыплят в каждой. Цыплятам опытных групп ветом 1.1 назначали с кормом в дозе 75 мг на 1 кг массы 1 раз в сутки до конца периода выращивания с использованием трех схем. В 1-й опытной группе двукратно – по 10 дней подряд, с интервалом в 20 дней, во 2-й опытной группе – 5-дневными циклами, с интервалом между назначением 5 дней, всего 5 циклов, в 3-й опытной группе – через 24 ч до завершения  эксперимента. В контрольной группе препарат не применяли.

Для  изучения действия препарата в динамике кровь у цыплят брали в 1-е сутки жизни и затем на 20, 40 и 60-е сутки непосредственно из сердца по методике Б.А. Шестеркина (1972) или из крыловой вены. Кровь стабилизировали 1%-м раствором гепарина на дистиллированной воде (2 капли на 5 мл крови). Иммунологические исследования включали определение: количества Т и В-лимфоцитов – методом образования розеток с эритроцитами барана; лизоцимную активность сыворотки крови – по отношению к лизирующему микрококку по И.Ф. Храбустовскому и соавт. (1979); бактерицидную активность сыворотки крови – по отношению к кишечной палочке по Мишелю и Трефферу (1956) в модификации Ю.М. Маркова и соавт. (1974).

Изучение иммунологических показателей крови показало, что до применения препарата у цыплят опытных и контрольной групп достоверных различий не было.

Проведенные нами исследования показали, что ветом 1.1 позитивно влияет на уровень бактерицидной (БАСК) и лизоцимной (ЛАСК) активности сыворотки крови ( табл. 21).

Таблица 21. Динамика бактерицидной активности сыворотки крови у подопытных цыплят, %

На 20-е сутки исследования БАСК у бройлеров 1, 2 и 3-й опытных групп была достоверно выше показателей аналогов из контроля соответственно на 11,6 (Р<0,01); 15,9 (Р<0,01) и 9,8 % (Р<0,05), на 40-е сутки опыта- на 7,8 (Р<0,05); 1,2 (Р<0,01) и 0,9 %. На 60-е сутки исследования бактерицидная активность сыворотки крови была выше аналогов из контроля только у цыплят-бройлеров 1-й и 2-й опытных групп соответственно на 6 (Р<0,05) и 11 % (Р<0,01) и ниже на 0,3 у птицы 3-й опытной группы.

Таким образом, под влиянием ветома 1.1 бактерицидная активность сыворотки крови повышается. Выраженность этих изменений зависит от схем применения препарата. Максимальный эффект достигнут при применении препарата 5-дневными циклами с интервалом 5 дней в дозе 75 мг на 1 кг массы ежедневно до конца периода выращивания. Более выраженные изменения БАСК отмечали в первые 20 суток с последующим снижением на 40-е и 60-е сутки.

Лизоцимная активность сыворотки крови (ЛАСК) цыплят-бройлеров опытных групп на протяжении всего опыта с различной степенью достоверности была выше, чем у птиц контрольной группы (табл. 22).

Таблица 22. Динамика лизоцимной активности сыворотки крови у подопытных цыплят-бройлеров, %

 На 20-е сутки опыта у цыплят-бройлеров 1-й опытной группы регистрировалось достоверное увеличение уровня лизоцимной активности по сравнению с контролем на 30,2 % (Р<0,05), к 40-м суткам исследования этот показатель у особей 1-й опытной группы превышал его в контроле на 15,7 % (Р<0,05). На 60-е сутки по ЛАСК цыплята 1-й опытной группы превышали контроль на 13,6 % (Р<0,01).

У цыплят-бройлеров 2-й опытной группы лизоцимная активность сыворотки крови превышала аналогов из контроля в 20, 40 и 60-суточном возрасте соответственно на 45,9 (Р<0,05); 32,3 (Р<0,001) и 23,7 % (Р<0,01).

Птица 3-й опытной группы по лизоцимной активности сыворотки крови также превышала аналогов из контроля в 20, 40 и 60-суточном возрасте соответственно на 3,8; 13,3 (результаты статистически не достоверны) и 11,6% (Р<0,05) (табл. 22).

Таким образом, ветом 1.1 повышает лизоцимную активность сыворотки крови. Максимальный эффект достигнут при применении препарата                  5-дневными циклами с интервалом 5 дней в дозе 75 мг на 1 кг массы ежедневно до конца периода выращивания.

Под влиянием ветома 1.1 содержание В-лимфоцитов в крови цыплят-бройлеров повышалось (табл. 23).

Таблица 23Количество В-лимфоцитов в крови подопытных цыплят-ройлеров, 10⁹/л

У цыплят-бройлеров 1, 2 и 3-й опытных групп на 20-е сутки исследования содержание В-лимфоцитов в крови было выше аналогов из контроля соответственно на 17,5; 47,5 (Р<0,01) и 7,5 %, на 40-е сутки - соответственно на 25,8; 33,9 (Р<0,01) и 16,1 %, в 60-суточном возрасте - на 25; 47,2 и 8,3 %.

Результаты наших исследований согласуются с данными Е.А. Лыковой и соавт. (1996), отмечавшей, что пробиотики способны регулировать число В-лимфоцитов и антительный ответ.

Лизоцим играет существенную роль в процессах регуляции клеточной дифференцировки и пролиферации, в обеспечении тканевого иммуноструктурного гомеостаза. При этом он оказывает как специфическое ферментное действие, так и неспецифическое влияние, принимает участие в регуляции проницаемости тканевых барьеров. Из литературных источников известно, что свежеполученная сыворотка крови обладает в разной степени бактериостатичностью и бактерицидностью в отношении многих видов микроорганизмов. Бактерицидность обусловлена присутствием в ней бактериолизинов, комплемента, лизоцима, пропердина, интерферона и лейкоцитов. Неспецифический бактериолизис вызывает лизоцим, усиливающий бактерицидное действие бактериолизинов. Таким образом, бактерицидная активность крови и ее сыворотки является суммарным показателем неспецифического гуморального иммунитета.

В-лимфоциты не способны отвечать образованием антител на воздействие антигена без кооперативных связей с Т-лимфоцитами. Синергизм Т-, В-лимфоцитов, макрофагов-моцитов обусловливает полноценный иммунный ответ организма. В его осушествлении и регуляции участвуют Т-хелперы, Т-супрессоры и продукты их жизнедеятельности (медиаторы – гуморальные регуляторы). По-видимому, ветом 1.1, как и другие пробитики, оказывает действие на организм через различные медиаторы, которые представляют собой либо компоненты микробной клетки, либо продукты метаболической активности пробиотических штаммов или нормальной микрофлоры кишечника. Эти медиаторы, достигая места своего приложения в нервной, гормональной, иммунной или иных тканях, органах и системах организма хозяина, прямо или опосредованно взаимодействуют в них с соответствующими рецепторами, структурами или ферментами, следствием чего являются благоприятные для макроорганизма изменения в его биохимических или физиологических функциях.

Полученные нами данные указывают на усиление гуморального звена неспецифической защиты организма цыплят-бройлеров под влиянием ветома 1.1.

В наших исследованиях количество Т-лимфоцитов, образующих спонтанные розетки в крови, у цыплят-бройлеров опытных групп было выше показателей аналогов из контроля (табл.24).

Таблица 24. Количество Т-лимфоцитов в крови подопытных цыплят-бройлеров, 10⁹/л

У цыплят 1-й и 2-й опытных групп на 20-е сутки исследований содержание Т-лимфоцитов в крови было выше аналогов из контроля соответственно на 4,7 и 7 %, а в 3-й группе ниже на 2,4 % (Р>0,1). На 40-е сутки исследования изучаемый показатель у цыплят 1-й, 2-й и 3-й опытных групп превышал аналогов из контроля соответственно на 24,3 (Р<0,05); 35,1 и 28,4 % (Р<0,01) и на 60-е сутки – на 32,7 (Р>0,1); 38,8 % (Р<0,05) и 12,2 % (Р>0,1). Выраженность этих изменений зависит от схемы и продолжительности применения препарата. Нами отмечено, что с увеличением продолжительности применения ветома 1.1 происходит постепенное снижение эффективности его действия. Так, у цыплят-бройлеров 3-й опытной группы по сравнению с показателями аналогов из 1-й группы уменьшалось количество Т-лимфоцитов на 20-е сутки исследований на 7,1 %; увеличивалось на 40-е сутки на 3,3 %, а на 60-е сутки вновь уменьшалось на 18,1 %.

Максимальный эффект был получен при применении препарата 5-дневными циклами с интервалом 5 дней в дозе 75 мг на 1 кг массы ежедневно до конца периода выращивания, всего 5 циклов. У цыплят 2-й опытной группы на 40-е сутки опыта количество Т-лимфоцитов в крови было выше аналогов из 1-й и 3-й опытных групп соответственно на 8,7 и 5,3 %.

При комплексной оценке влияния ветома 1.1 на содержание в крови В- и Т- лимфоцитов, ЛАСК и БАСК также установлено, что максимальный эффект получен при применении препарата 5-дневными циклами с интервалом 5 дней в дозе 75 мг на 1 кг массы ежедневно до конца периода выращивания. Так, цыплята-бройлеры 2-й опытной группы на 40-е сутки опыта по БАСК превышали показатели аналогов из 1-й и 3-й опытных групп соответственно на 3,2 и 10,1 %, по ЛАСК – на 14,4 и 16,7 %, В-лимфоцитов – на 5,1 и 13,9 % и Т-лимфоцитов - на 8,7 и 5,3 %.

С увеличением продолжительности применения ветома 1.1 происходит постепенное снижение эффективности его действия. Так, у цыплят-бройлеров 3-й опытной группы по сравнению с показателями аналогов из 1-й группы наблюдалось уменьшение уровня БАСК, ЛАСК и количества В-лимфоцитов на 20-е сутки исследований соответственно на 1,6; 25,1 и 9 %; на 40-е сутки – на 6,7; 2 и 8,3 % и на 60-е сутки – на 6,2; 1,8 и 20 %.

 По регуляции Т-клеточного иммунитета с использованием пробиотиков данные авторов разнятся. Отмечено как стимулирующее, так и супрессивное воздействие живых и убитых молочно-кислых бактерий на различные классы Т-лимфоциотов. По-видимому, это связанно с исходным состоянием иммунной системы и использованием различных методов их определения, а также применением пробиотиков в различных дозах. Так, при воздействии на макрофаги и Т-клеточные линии 14 штаммами убитых бифидобактерий выявлено, что большинство бифидобактерий увеличивало продукцию цитокинов макрофагами (Marin et al., 1997). Наши данные согласуются с исследованиями И.М. Карпуть и соавт. (1996), которые отмечали увеличение количества Т-лимфоциотов в крови у цыплят-бройлеров при применении энтеробифидина из бифидобактерий и препарата из лакто-, бифидо- и пропионовых бактерий.

Полученные нами данные могут свидетельствовать о стимуляции ветомом 1.1 клеточных факторов иммунитета у цыплят-бройлеров в пределах верхних границ физиологической нормы.

Следовательно, увеличение этих показателей при применении ветома 1.1 может свидетельствовать о повышении уровня неспецифической резистентности организма цыплят-бройлеров

Таким образом, ветом 1.1 оказывает стимулирующее влияние на лимфоцитопоэз и, следовательно, на гуморальный и клеточный иммунитет, так как происходит одновременное повышение количества В- и Т-лимфоцитов, возрастает бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови. Следовательно, ветом 1.1 оказывает иммуномодулирующее действие и повышает неспецифическую резистентность организма цыплят-бройлеров в пределах физиологических возможностей и их устойчивость к действию неблагоприятных факторов внешней среды.