3. Хронофармакология пробиотиков при гастроэнтерите у телят

3.1.  Влияние циркадианных и сезонных биологических ритмов на терапевтическую эффективность ветома 3 при гастроэнтерите у телят

Реакция на вещество во времени должна непременно варьировать в прямой зависимости от того,  на какую фазу биоритма она приходится. По мнению Э.Б. Арушаняна (2000), это вынуждает к пересмотру существующих в экспериментальной практике и клинике количественной оценки фармакологического эффекта. В частности, резонно распространить на существующие сегодня экспериментальные подходы предложенный F. Halberg et al. (1962) критерий хронодесмы, под которым подразумеваются доверительные колебания какого-либо функционального показателя во времени.

В преимуществе такого приема перед существующими стационарными методами оценки убеждает тот факт, фармакологический ответ может быть выше или ниже средней величины, рассчитанной для стационарных условий, хотя он и не выходит за пределы физиологических колебаний той или иной функции. Напротив, реакция может ошибочно приниматься за адекватную, тогда как на самом деле оказывается ниже или выше нормальной величины, находясь при этом в зоне стационарной нормы (Арушанян Э.Б., 2000).

Согласно концепции F. Halberg и A. Reinberg (1967), при обычной терапии равномерно повторяемое одинаковое лекарственное воздействие каждый раз вызывает разный эффект вплоть до развития побочных реакций. При хронотерапии, когда препарат назначается в разных дозах на протяжении суток в зависимости от фаз биоритмов, чувствительности к нему, можно получить одинаковую желаемую реакцию без риска развития побочных эффектов.

Хронотерапия включает следующие методологические приемы: превентивные, имитационные, метод «навязывания ритма» (Комаров Ф.И., 1988) и метод учета хроночувствительности заинтересованных систем (функций) к фармакологическим веществам (Заславская Р.М., 1991, 1996).

Имитационный метод хронотерапии основывается на уже установленных закономерностях изменений концентрации определенных веществ в крови и тканях в соответствии с характерным для здорового индивидуума биоритмом (Заславская Р.М., 1991).

Метод «навязывания ритма» основан на использовании лекарственных и нелекарственных средств, для задания организму больного животного определенных ритмов, приближающихся к нормальным ритмам определенного вида.

Метод учета основан на выявлении хроночувствительности заинтересованных систем, в частности сердечно-сосудистой, к фармакологическим препаратам разных классов. Р.М. Заславская (1991, 1996), К.Ж. Ахметов (1993) применяли метод учета хроночувствительности заинтересованных систем в группах больных гипертонической болезнью. Используя данный метод, Ж.Ж. Кулкаева (1997) выявила времязависимые эффекты и суточный ритм чувствительности показателей гемодинамики к пропранополу, метопрололу, верапамилу, кордипину при лечении ишемической болезни сердца.

Изучению сезонных особенностей фармакологической чувствительности живых организмов посвящены работы А.П. Голикова и П.П. Голикова (1973); С.И. Рапопорта и соавт. (1987) и многих других. Так, по данным С.А. Лужновой и Н.Г. Урляповой (2004), степень влияния диаминодифинилсульфона на гематологические показатели мышей сопряжена с сезоном года. В работе О.Ю. Леденевой (2003) указывается на наличие сезонных особенностей фармакологического эффекта пробиотического препарата ветомгин при эндометрите у коров. В.М. Фещенко (2003) отмечает, что терапевтический эффект пробиотического препарата ветом 4 и низкоинтенсивного лазерного излучения при бронхопневмонии у поросят также зависит от сезона года.

Период биоритма любого функционального или структурного процесса регулируется ритмами его энергообеспечения. Присутствие в пространственной организации биологической системы градиентов протекающих в ней процессов должно учитываться при исследовании механизмов регуляции деятельности системы в качестве основы возникновения в ней различных реакций на влияние регулирующих факторов в зависимости от точки приложения их действия в градиенте, а также дает возможность избирательного пространственного градиентного воздействия на систему внешними факторами, в том числе лекарственными средствами (Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., 2000).

Наличие существенных суточных колебаний эффективности терапевтического воздействия известно уже для многих классов лекарственных веществ, в частности для гипотензивных средств, противогистаминных, цитостатических, гормональных препаратов, наркотических средств, для многих из этих препаратов изучена хронотоксикология, а также сезонные колебания их действия (Зидермане А.А., 1988; Арушанян Э.Б., 1988, 2000).

Однако все вышеперечисленные данные в основном представлены из опытов на лабораторных животных, либо путем простого наблюдения за больными людьми, Сельскохозяйственные и домашние животные как объект биоритмологии,  хронофармакологических исследований остаются «белым пятном» до сих пор.

С целью выявления зависимости терапевтической эффективности ветома 3 у телят, больных гастроэнтеритом, от хронобиологических факторов изучали особенности течения болезни при применении препарата в различное время суток, его влияние на морфологические и биохимические показатели периферической крови и интенсивность роста больных животных.

Для определения сезонных особенностей терапевтической эффективности ветома 3 провели две аналогичные серии опытов летом и осенью (табл. 2).

Исследования проводились на двухмесячных телятах черно-пестрой породы с характерными признаками гастроэнтерита. Диагноз был установлен на основании анамнеза и клинических признаков. Животных по принципу аналогов разделили на 5 опытных и контрольную группы животных по 5 телят в каждой. Животным опытных групп назначали ветом 3 в дозе 50 мг/кг массы дважды в сутки с водой в различное время: в 1-й группе – в 7 и 19 ч,  2-й – в 8 и 20 ч, 3-й – в 9 и 21 ч, 4-й – в 10 и 22 ч, 5-й – в 11 и 23 ч. Пробиотик назначали до полного клинического выздоровления. Телятам из контроля ветом 3 не применяли, животных лечили по схеме, традиционно применяемой в данном хозяйстве: в качестве антибактериального средства назначали гентамицина сульфат в дозе 2 мг/кг массы внутримышечно 2 раза в день. Кроме того, животным всех групп проводили регидратационную и восстановительную терапии (табл. 2).

Таблица 2. Схема опыта

Взятие крови проводили из яремной вены перед началом и по окончанию исследований.

Для изучения хронофармакологических особенностей влияния препарата на состояние неспецифической резистентности и обмена веществ, проводили гематологические и биохимические исследования крови.

Морфологические исследования крови включали определение уровня эритроцитов и лейкоцитов (меланжерным способом с использованием камеры Горяева), гемоглобина (по Сали), скорости оседания эритроцитов (по Панчекову). Кроме того, в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза,  определяли лейкограмму  (по Болотникову И.А., 1980).

Биохимические исследования крови включали определение уровня общего белка и белковых фракций (рефрактометрический метод), холестерина (ферментативный колориметрический метод), мочевины (фотометрический метод по реакции с диацетилмонооксимом), креатинина (реакция Яффе с последовательной фотометрией по Слоту), билирубина и его фракций (фотометрический модифицированный метод Йендрашека-Грофа), аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (фотометрический метод Райтмана-Френкеля), кальция (фотометрическое определение по реакции с арсеназо-III) и фосфора (фотометрическое определение по реакции с молибденовокислым аммонием), рассчитывали коэффициент де Ритиса и показатель фосфорно-кальциевого отношения (Комаров Ф.И. и соавт., 2001). Для проведения биохимических исследований использовали реактивы ЗАО «Вектор-Бест» (для определения мочевины – реактивы фирмы Lachema).

Временную организацию действия ветома 3 на показатели крови и живой массы животных изучали с помощью графически-параметрического метода анализа биологических ритмов (Романов Ю.А., 1979) и определяли следующие параметры: мезор – среднее значение показателей (фазы) за промежуток времени; акрофазу – момент крайнего отклонения фазы; активную (пассивную) фазы – значения фазы, лежащие выше (ниже) мезора; абсолютную амплитуду – разность между максимальным и минимальным значениями фазы; относительную амплитуду – отношение максимального к минимальному значению фазы; коэффициент синхронизации – отношение относительной амплитуды к промежутку времени между максимальным и минимальным значениями фазы (Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., 2000).

Обработку данных проводили методами вариационной статистики с использованием программы «PGN-1.4». Достоверность результатов определяли с помощью критерия Стьюдента.

Установлено, что препарат обладает выраженным терапевтическим действием при гастроэнтерите. Улучшение состояния животных 1–5-й опытных групп, как в летний, так и в осенний периоды, отмечалось уже на 2-3-и сутки после начала лечения. У животных появлялся аппетит, нормализовались температура, пульс и частота дыхания; дефекация отмечалась реже, кал приобретал кашицеобразную консистенцию, уменьшалось количество не переваренных остатков корма. В то время как у животных контрольной группы заметных изменений в течение болезни не отмечали.

Температура тела у телят 1–5-й опытных групп после выздоровления в летний период была ниже по сравнению с контролем на 2,31; 1,29; 1,03; 1,54; 1,03 %, а по сравнению с исходными данными – на 2,56; 1,79; 1,53; 1,29; 1,03% соответственно, тогда как у животных из контроля температура тела по сравнению с исходными данными не изменилась. Необходимо отметить, что, если в 1-й и 2-й опытных группах отмечается плавное стабильной снижение температуры за весь период лечения, то в контрольной группе отмечается даже некоторый подъем температуры в первые 3-е суток лечения. В 3–5-й опытных группах также отмечалось снижение температуры, но более медленное с редкими периодами подъема (рис. 5).

В активной фазе (в данном случае ниже мезора, т.к. изначально вследствие воспалительной реакции, обусловленной гастроэнтеритом, температура была повышена) влияния ветома 3 на уровень температуры у телят в летний период находились показатели 1-й и 4-й опытных групп, которые были ниже мезора (38,34±0,15 °С) на 0,9 (P<0,05) и 0,3 %, в пассивной фазе – показатели 2, 3 и 5-й опытных групп, которые превышали мезор на 0,2; 0,4 и 0,4 % соответственно. Продолжительность активной фазы была в 4 раза короче пассивной фазы. Абсолютная амплитуда показателей температуры телят составила 0,5 °С, относительная амплитуда – 1,01 ед. Коэффициент синхронизации влияния ветома 3 на уровень температуры телят составил 0,51 ед/ч.  Акрофаза (в данном случае минимальное значение) влияния ветома 3 на уровень температуры телят приходилась на 7 и 19 ч, что соответствует показателям телят 1-й опытной группы (рис. 5). 

Рис. 5. Динамика показателей температуры телят в летний период

Температура тела у телят 1–5-й опытных групп после выздоровления осенью была ниже по сравнению с контролем на 1,54 (P<0,1); 1,8 (P<0,05); 1,03; 1,29 (P<0,01); 0,51 % соответственно. По сравнению с исходными данными температура тела у телят 1–5-й опытных и контрольной групп была ниже на 2,29; 2,3; 1,03; 2,29; 0,77 и 0,26 % соответственно. Необходимо отметить, что если во 2-й и 4-й опытных группах отмечается плавное и стабильное снижение температуры за весь период лечения, то в контрольной группе отмечается даже некоторый подъем температуры на 3-4-е сутки лечения. В 1, 3 и 5-й опытных группах также отмечалось снижение температуры, но более медленное с редкими периодами подъема (рис. 7).

Примечание: здесь и далее АФ – активная фаза, Акрф – акрофаза

Рис. 7. Динамика показателей температуры телят в осенний период                     

В активной фазе (в данном случае ниже мезора, т. к. изначально вследствие воспалительной реакции, обусловленной гастроэнтеритом, температура была повышена) влияния ветома 3 на уровень температуры телят в осенний период находились показатели 1, 2 и 4-й опытных групп, которые были ниже мезора (38,42±0,08 °С) на 0,3, 0,6 (P<0,1) и 0,1 %, в пассивной фазе – показатели 3 и 5-й опытных групп, которые превышали мезор на 0,2 и 0,7 % соответственно. Продолжительность активной фазы была  на 28,6 % длиннее пассивной фазы. Абсолютная амплитуда показателей температуры телят составила 0,5 °С, относительная амплитуда – 1,01 ед. Коэффициент синхронизации влияния ветома 3 на уровень температуры телят составил 0,34 ед/ч.  Акрофаза (в данном случае минимальное значение) влияния ветома 3 на уровень температуры телят приходилась на 8 и 20 ч, что соответствует показателям телят 2-й опытной группы (рис. 8).

Таким образом, под влиянием ветома 3 происходило стабильное снижение температуры у подопытных телят. Выраженность фармакологического эффекта пробиотика находилась в зависимости от времени применения препарата: коэффициент синхронизации хронограмм в летний и осенний периоды составил 0,51 и 0,34 ед./ч. Оптимальное снижение температуры при применении препарата в летний период отмечено  в 7 и 19 ч, осенью – в 8 и 20 ч, при этом показатели температуры были достоверно ниже мезора на 0,9 и 0,6 % соответственно.

При проведении опыта отмечены также изменения частоты пульса у подопытных телят.

У телят 1, 2 и 4-й опытных групп после выздоровления в летний период частота пульса была недостоверно ниже по сравнению с контролем на 1,56 % соответственно, тогда как у животных 3-й и 5-й опытных групп данный показатель находился на уровне контроля. По сравнению с исходными данными частота пульса у телят 1-й опытной и контрольной групп недостоверно снизилась на 3,1 и 1,5 % соответственно, тогда как у животных 2-й и 5-й опытных групп – увеличилась на 1,6 и 3,2 %, а у аналогов 3-й и 5-й опытных групп – не изменилась по сравнению с исходными данными (рис. 9).

Анализ хронобиологических особенностей влияния ветома 3 на частоту пульса в летний период не позволяет сделать однозначных выводов.

Рис. 9. Динамика частоты пульса у подопытных телят в летний период

У телят 1, 2, 3 и 4-й опытных групп после выздоровления в осенний период частота пульса была недостоверно ниже по сравнению с контролем на 1,56; 1,56; 3,12 и 1,56 % соответственно, тогда как у животных 5-й опытной группы данный показатель находился на уровне контроля. По сравнению с исходными данными частота пульса у телят 1, 2, 3 и 4-й опытных групп недостоверно снизилась на 3,08; 3,08; 1,59; 1,56 % соответственно, тогда как у животных 5-й опытной группы – увеличилась на 1,59 %, а у аналогов из контроля – не изменилась по сравнению с исходными данными. Необходимо отметить, что в течение опыта стабильно понижалась частота пульса только у телят 2-й опытной группы, тогда как у животных 1, 3, 4, 5-й опытных и контрольной групп снижение частоты пульса чередовалось с периодами подъема (рис. 10).

Анализ хронобиологических особенностей влияния ветома 3 на частоту пульса в осенний период также не позволяет сделать однозначных выводов.

Рис. 10. Динамика частоты пульса у подопытных телят в осенний период

При проведении опыта отмечены также изменения частоты дыхательных движений у подопытных телят.

У телят 1, 2 и 3-й опытных групп после выздоровления в летний период частота дыхательных движений была недостоверно ниже по сравнению с контролем на 5,6; 5,6 и 11,1 % соответственно, тогда как у животных 4-й и 5-й опытной группы данный показатель находился на уровне контроля. По сравнению с исходными данными, частота дыхательных движений у телят 1–5-й опытных групп недостоверно снизилась на 5,6; 10,5; 15,8; 10,0; 5,3 % соответственно, тогда как у животных контрольной группы данный показатель не изменился по сравнению с исходными данными (рис. 11).

Рис. 11. Динамика частоты дыхательных движений у подопытных телят в летний период

Рис. 12. Динамика частоты дыхательных движений у подопытных телят в осенний период

У животных 1–5-й опытных групп после выздоровления в осенний период частота дыхательных движений была недостоверно ниже по сравнению с контролем на 5,3; 10,5; 10,5; 5,3; 10,5 % соответственно. По сравнению с исходными данными частота дыхательных движений у телят 1–5-й опытных групп недостоверно снизилась на 5,3; 5,6; 10,5; 10,0; 5,6 % соответственно, тогда как у животных контрольной группы – увеличилась на 5,6 %  (рис.12).

Таким образом, при применении ветома 3 как в летний, так и осенний периоды, отмечена тенденция к снижению частоты пульса и дыхательных движений, однако, анализ хронобиологических особенностей влияния препарата на данные показатели не позволяет сделать однозначных выводов.

При применении ветома 3 отмечено снижение продолжительности лечения телят опытных групп.

В летний период продолжительность лечения телят 1–5-й опытных групп была достоверно ниже по сравнению с аналогами из контроля на 52,25 (P<0,01); 40,93 (P<0,05); 29,6; 29,6; 22,65 (P<0,1) % соответственно (табл. 10).

Наименьшая продолжительность лечения телят была отмечена в 1-й опытной группе, где уже на 3-и сутки опыта половина животных была клинически здорова, и средняя продолжительность лечения составила 3,5±0,42 суток. В контрольной группе показатель продолжительности лечения составил 7,33±0,61 суток и на 3-и сутки лечения не было ни одного выздоровевшего животного (табл. 10).

В активной фазе (в данном случае ниже мезора) влияния ветома 3 на продолжительность лечения телят в летний период находились показатели  1-й и 2-й опытных групп, которые были ниже мезора ((4,76±0,68) суток) на 26,5 и 9,0 %, в пассивной фазе – показатели 3, 4 и 5-й опытных групп, которые превышали мезор на 8,4; 8,4 и 19,1 % соответственно. Продолжительность активной фазы была на 40 % короче пассивной фазы. Абсолютная амплитуда показателей продолжительности лечения телят составила 2,17 суток, относительная амплитуда – 1,62 ед. Коэффициент синхронизации влияния ветома 3 на продолжительность лечения телят составил 0,41 ед./ч. Акрофаза (минимальное значение) влияния ветома 3 на продолжительность лечения телят летом приходилась на 7 и 19 ч, что соответствует показателям телят 1-й опытной группы (рис. 13).

Таблица 10

Продолжительность лечения телят в летний период

В осенний период продолжительность лечения телят 1–5-й опытных групп была достоверно ниже, по сравнению с аналогами из контроля на 37,24 (P<0,05); 41,84 (P<0,01); 32,64 (P<0,05); 25,66 (P<0,1); 23,29 (P<0,1) % соответственно.

Наименьшая продолжительность лечения была отмечена во 2-й группе и составила 4,17±0,4 суток, тогда как в контрольной группе продолжительность лечения составила 7,17±0,4 суток (P<0,05). В 1, 2 и 3-й опытных группах уже на 3-и сутки опыта 2 из 5-ти животных были клинически здоровы, в контрольной группе на 3-и сутки лечения не было ни одного выздоровевшего животного (табл. 11) Таблица 11

Продолжительность лечения телят в осенний период

В активной фазе (в данном случае ниже мезора) влияния ветома 3 на продолжительность лечения телят в осенний период находились показатели 1, 2 и 3-й опытных групп, которые были ниже мезора ((4,87±0,25) суток) на 7,6; 14,4 и 0,8 %, в пассивной фазе – показатели 4 и 5-й опытных групп, которые превышали мезор на 9,4 и 12,9 % соответственно. Продолжительность активной и пассивной фаз были равными. Абсолютная амплитуда показателей продолжительности лечения телят составила 1,33 суток, относительная амплитуда – 1,32 ед. Коэффициент синхронизации влияния ветома 3 на продолжительность лечения телят составил 0,44 ед./ч.  Акрофаза (минимальное значение) влияния ветома 3 на продолжительность лечения телят осенью приходилась на 8 и 20 ч, что соответствует показателям телят 2-й опытной группы (рис. 14).

Таким образом, ветом 3 обладает выраженным терапевтическим эффектом при гастроэнтерите у телят, который находится в прямой зависимости от времени введения препарата и сезона года – коэффициент синхронизации влияния пробиотика на продолжительность лечения в летний и осенний периоды составлял 0,41 и 0,44 ед./ч соответственно. Оптимальный терапевтический эффект получен при применении препарата в 7 и 19 ч в летний период, и в 8 и 20 ч – осенью, при этом продолжительность лечения телят была ниже мезора на 26,5 и 14,4 % соответственно. Ветом 3 при применении в указанные временные рамки вызывал стабильное снижение температуры, причем акрофаза показателя была ниже мезора на 0,9 и 0,6 % в летний и осенний периоды соответственно.

Полученные результаты согласуются с данными ряда авторов о зависимости физиологических показателей живых организмов от фазы биологического ритма. Такие ритмы называют физиологическими. Влияние биологических ритмов на физиологические показатели закреплено эволюционно и основано на различной восприимчивости нейрогуморальных структур к внешним воздействиям (свет, температура окружающей среды и т.д.) в разные периоды суток. Соответвенно, терапевтическое воздействие на живой организм в различные периоды активности физиологических систем вызывает различный эффект. По нашим данным, оптимальное влияние ветома 3 на физиологические показатели телят, больных гастроэнтеритом, различно в летний и осенний периоды, что в свою очередь согласуется с концепцией сезонной организации биологических систем (сезонные биологические ритмы).