2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования
Тема диссертации является разделом научно-исследовательской работы кафедры фармакологии и общей патологии Новосибирского государственного аграрного университета, номер государственной регистрации 01.200.11.3903.
Экспериментально-клинические исследования проведены в 1999, 2000, 2002 годах в учхозе «Тулинское» Новосибирского государственного аграрного университета. Лабораторные исследования осуществлялись в биохимических лабораториях г. Новосибирска, на кафедре фармакологии и общей патологии и на базе НИВГиС НГАУ.
Нами проведены 3 серии опытов: два осенью (1999, 2000) и один весной (2002) на поросятах 15-20-дневного возраста скороспелой мясной породы СМ- 1. Для этого по принципу аналогов с учетом клинических признаков гастроэнтерита и тяжести течения заболевания сформировали по 4 подопытных группы поросят в каждой серии. Поросята 1-й опытной группы получали внутрь с водой ветом 4 в дозе 50 мг/кг живой массы 2 раза в день до выздоровления. Животным 2-й опытной группы вводили внутрь с водой ветом 4 в дозе 50 мг/кг 1 раз в день до выздоровления и проводили трехкратно через день лазеротерапию. Поросята 3-й опытной группы облучались трехкратно через день низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ). В контрольной группе не применяли препарат ветом 4 и не проводили лазеротерапию. Животных из контроля лечили по схеме, традиционной для данного хозяйства, с использованием антибиотиков и соблюдением диеты.
Объектом изучения был препарат ветом 4, представляющий собой мелкий кристаллический продукт, содержащий микробную массу живых антагонистически активных клеток штаммов споровой формы бактерий Bacillus licheniformis.
Лазеротерапия осуществлялась при помощи полупроводникового низкоэнергетического прибора «Мустанг-017».Трехкратное низкоинтенсивное лазерное облучение поросят проводилось в области контролирующего или дорсального срединного канала. Во время 1-й процедуры использовали лазерное излучение с длиной волны 0,89 мкм, частотой 600 Гц, мощностью 5?10 мВт и экспозицией 32 секунды. При 2-й процедуре увеличивали время воздействия до 64 секунд, а остальные параметры оставались без изменения. В 3-й процедуре повышали мощность до 6?1мВт при неизменной длине волны, экспозиции и частоте. Все процедуры проводились через день. Для облучения использовали излучатель MЛ01К.
Для изучения терапевтической эффективности препарата ветом 4 и НИЛИ ежедневно проводили клинический осмотр, учет тяжести течения заболевания, степени обезвоживания, характера каловых масс, продолжительности лечения, гематологических и биохимических показателей.
Влияние ветома 4 и НИЛИ на гематологические показатели крови устанавливали по количеству эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и изменению в лейкоформуле.
При изучении влияния ветома 4 и НИЛИ на биохимический состав сыворотки крови устанавливали содержание холестерина, билирубина, мочевины, креатинина, глюкозы в сыворотке крови поросят.
Для определения влияния ветома 4 и НИЛИ на белковый обмен учитывали изменения общего белка, альбуминов, a-, b-, g-глобулинов.
При изучении влияния ветома 4 и НИЛИ на ферментный состав сыворотки крови поросят определяли содержание АЛТ, АСТ, коэффициент Де Ритиса, щелочной, кислой общей и простатической фосфатаз.
Для выяснения влияния ветома 4 и НИЛИ на минеральный обмен изучали изменение количества кальция, фосфора и соотношение Са?Р.
Влияние препарата ветом 4 и НИЛИ на неспецифическую резистентность поросят оценивали по количеству эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов, гемоглобина, общего белка, g-глобулинов, сиаловых кислот, ЛКТ, титру нормальных антител к Brucella abortus.
При определении ростостимулирующей эффективности действия препарата ветом 4 и НИЛИ учитывали в динамике абсолютную и относительную массу животных, показатели среднесуточного прироста живой массы и скорости роста поросят, изменение общего состояния, наличие нежелательных побочных эффектов.
Количество эритроцитов определяли на ФЭК-56 и меланжерным способом с использованием камеры Горяева. Концентрацию гемоглобина определяли по унифицированному гемиглобинцианидному методу (1974) на ФЭК-56. СОЭ определяли по унифицированному микрометоду Панченкова (1972). Количество лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, определяли лейкоформулы по унифицированному методу морфологического исследования форменных элементов крови с дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы (1979). Уровень ЛКБ определяли по модифицированному методу Пигаревского (1981). Известно, что бактерицидное действие не ферментных цитоплазматических катионных белков основывается на изменении активности ферментативных процессов и нарушении структуры мембран различных возбудителей. Основная роль здесь принадлежит нейтрофилам, катионные белки которых, соединяясь с анионным красителем прочного зеленого цвета при рН 8,1-8,2, образуют ионные связи. Это способствует окраске гранул зернистых лейкоцитов в зеленый цвет. Учитывая интенсивность окраски и количество окрашенного материала, определяли лизосомально-катионный тест (ЛКТ) (Шубич М.Г. и соавт.,1980; Пигаревский В.Е. и соавт., 1981; Полтавцева Р.А.,1997; Славинский А.А и соавт.,1999).
Общий белок изучали рефрактометрическим методом. Белковые фракции определяли турбидиметрическим (нефелометрическим) методом, основанным на том, что различные белковые фракции сыворотки крови способны осаждаться фосфатными растворами определенной концентрации. При этом образуется очень мелкая взвесь, и раствор мутнеет. По степени мутности растворов, устанавливаемой с помощью фотоэлектроколориметра, судят о концентрации белков в исследуемой пробе.
Общий и конъюгированный билирубин устанавливали по реакции диазотирования билирубина диазосульфаниловой кислотой в присутствии ускорителя реакции кофеин-бензоата натрия (общий билирубин) и в отсутствии ускорителя (коньюгированный билирубин). В результате реакции образуется раствор красного цвета с максимумом поглощения при длине волны 535 нм (510-550 нм), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации билирубина.
Активность общей и простатической кислой фосфатазы в сыворотке крови определяли, основываясь на гидролизе n-нитрофенилфосфата (pNpp) в кислой среде с образованием n-нитрофенола (pNp). Активность общей кислой фосфатазы пропорциональна интенсивности окраски pNp в щелочной среде (после остановки реакции) и измеряется фотометрически при длине волны 405 нм. Простатическая тартратлабильная фосфатаза определяется по разности общей и остаточной активности, полученной в присутствии тартрата.
Принцип определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови основывался на гидролизе n-нитрофенилфосфата (pNpp) ферментом с образованием свободного n-нитрофенола (pNp). В щелочной среде pNp окрашен в желтый цвет, интенсивность окраски которого пропорциональна ферментной активности щелочной фосфатазы, измеряемой фотометрически по длине волны (400-420 нм).
Определение активности АЛТ и АСТ в сыворотке крови основано на изменении оптической плотности при длине волны 490 (490-540) нм окрашенных в щелочной среде 2,4-динитрофенилгидразонов ?-глутаминовой и пировиноградной кислот. Гидразон пировиноградной кислоты обладает гораздо более высокой оптической плотностью, чем гидразон ?-глутаминовой кислоты. Концентрация образовавшегося гидразона пировиноградной кислоты пропорциональна активности АЛТ (АСТ).
Концентрация глюкозы определяется на основе того, что при окислении ?-D-глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перикиси водорода. Под действием пероксидазы перикись водорода окисляет 4-аминоантипирин (4-ААП) в присутствии фенола в окрашенное соединение розово-малинового цвета, определяемое фотометрически.
Концентрацию общего холестерина и мочевины в сыворотке крови определяли ферментативным методом.
Для проведения биохимических исследований использовали наборы реактивов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск): «НОВОБИЛ»- для определения общего и коньюгированного билирубина в сыворотке крови, «Фосфацид-НОВО» для фотометрического определения активности кислой фосфатазы (общей и простатической) в сыворотке крови, «Новофосфол»- для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови, «Трансаминаза-АСТ-НОВО», «Новоглюк» для определения концентрации глюкозы в цельной крови, сыворотке и плазме глюкозооксифазным методом, «новохол», «Новокарб»- для ферментативного определения мочевины в сыворотке крови и моче.
Содержание креатинина в сыворотке крови определяли с использованием набора реактивов чешского производства LACHEMA.
Концентрацию кальция изучали колориметрически без депроитенизации при длине волны 578 нм (550-590 нм), при помощи набора реактивов «Кальций-СРС», производимого в Германии фирмой BIOCON.
Содержание неорганического фосфора в сыворотке крови определяли с использованием набора реактивов «Неорганический фосфат», производимого в Германии фирмой BIOCON.
Концентрацию сиаловых кислот в сыворотке крови определяли по Гесу.
Титры антител на антиген Brucella abortus определяли с помощью реакции агглютинации (РА), согласно «Временному наставлению по применению моноантигенов для серологической диагностики бруцеллеза». Для определения титров антител применяли иммунологические пластины с сывороткой в различных разведениях. В каждую лунку пластинки добавляли по 0,05 антигена. Смесь компонентов реакции в каждой лунке перемешивали и помещали в термостат при 370С на 1 час, а затем в холодильник при температуре 40С на 10-12 часов. Положительной считается реакция, когда наблюдается агглютинат, не разбивающийся при встряхивании и не замутняющий надосадочную жидкость. Полученные результаты титров АТ выражали через модуль десятичного логарифма (lg X).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы биометрической обработки «PGN-1,0», разработанной И.В. Наумкиным и В.В. Гартом (1991). Достоверность полученных результатов определяли с помощью критерия Стьюдента.
2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Терапевтическая эффективность ветома 4 и НИЛИ при гастроэнтерите
Для изучения терапевтической эффективности ветома 4 и НИЛИ при лечении поросят с диагнозом гастроэнтерит были проведены опыты в 1999,2000,2002 годах. Нами установлено, что ветом 4 и НИЛИ как при индивидуальном, так и при сочетанном их применении обладают выраженным терапевтическим действием при гастроэнтерите у поросят. Продолжительность лечения поросят опытных групп за 3-летний период была меньше в среднем в 1-й опытной группе на 1,7-2,1 дня, во 2-й группе на 2,6-3,0 дня, в 3-й на 1,0-1,5 дня по сравнению с контролем. Оптимальный результат (1999, 2000, 2002) получен во 2-й опытной группе при сочетанном применении ветома 4 и НИЛИ. Продолжительность лечения поросят 2-й группы была меньше по сравнению с 1-й и 3-й опытными группами в среднем на 0,7-1,0 и 1,3-1,6 дня соответственно. Таким образом, ветом 4 и НИЛИ при сочетанном применении обеспечивают максимальную терапевтическую эффективность при гастроэнтерите у поросят.
