Биотехнология и микробиология 

УДК 579.26 +632.937 

А.А. Леляк¹, М.В. Штерншис²

¹ Научно-производственная фирма «Исследовательский центр»,

наукоград Кольцово, Новосибирская обл., Россия

² Новосибирский государственный аграрный университет, г. Новосибирск, Россия

Антагонистический потенциал сибирских штаммов

Bacillus spp. в отношении возбудителей болезней

животных и растений

Наибольшее антагонистическое действие сибирских штаммов бактерий Bacillussubtilis, Bacillusamyloliquefaciens и Bacilluslicheniformisв отношении патогенов отмечено для St. aureus. Высокой активностью в отношении C. albicansобладали штаммы B. subtilis ВКПМ В-16041, DSM 24613, B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, DSM 24614 и B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, DSM 24615. Все штаммы показали наличие бактерицидного действия средней и слабой степени в отношении других использованных в опыте грамотрицательных бактерий – C. freundii, E. coli, K. pneumonia, P. vulgaris, P. aeruginosa, Salmonellasp., Sh. sonnei, Sh. flexneriIIa. Эти же штаммы бактерий-антагонистов проявили ингибирующие свойства в отношении большинства использованных в опыте фитопатогенов. На возбудителя альтернариоза A. solani наибольшее ингибирующее действие оказали штаммы B. amyloliquefaciensBa-1и Ba-2, B. licheniformis ВКПМ В-10561, DSM 24609 и B. subtilisBs-1. В подавлении роста возбудителя корневых гнилей B. sorokiniana высокую активность проявили штаммы B. subtilisBs-1, B. amyloliquefaciensBa-1 и Ba-2, которые также были максимально активными по сравнению с остальными по отношению к возбудителю серой гнили растений B. cinerea. В то же время установлено, что штаммы B. licheniformis не подавляли роста B. cinerea. Против фитопатогенных грибов рода Fusarium и возбудителя фитофтороза пасленовых культур Ph. infestans все изученные бактерии Bacillusspp. показали высокий уровень ингибирующей активности. У бактерий B. licheniformisBl-1; ВКПМ В-10562, DSM 24610 и ВКПМ В-10564, DSM 24612 отсутствовала антагонистическая активность в отношении F. solani ВКПМ В-163.
Ключевые слова: антагонистическая активность, Bacillussubtilis, Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, патогенные бактерии, фитопатогенные грибы.

Введение

Спорообразующие бактерии рода Bacillus являются продуцентами широкого спектра биологически активных веществ (БАВ), в том числе ферментов, липопептидных и других антибиотиков, спектр которых зависит от географического происхождения изолятов [1, 2]. Продукция БАВ обусловливает высокую бактерицидную и бактериостатическую активность Bacillusspp. в отношении патогенных грамположительных (Clostridiumspp.,Corynebacteriumspp., Staphylococcusaureus) и грамотрицательных (Treponemapallidum, Neisseriameningitis) бактерий [3], а также фунгицидную (фунгистатическую) активность в отношении фитопатогенных грибов – Rhizoctoniasolani, Botrytiscinerea, Aspergillusniger [4, 5]. Таким образом, представители рода Bacillus обладают бактерицидной и фунгицидной активностью, и рассматриваются как перспективные биологические агенты для создания противомикробных препаратов. Пробиотики на основе бактерий B. subtilisуспешно применяют в медицине для терапии инфекций различной этиологии [6–8]. В ветеринарной медицине препараты и кормовые добавки, включающие в качестве действующего начала бактерии рода Bacillus, используют для снижения падежа, повышения привесов, снижения конверсии кормов в свиноводстве [9, 10], птицеводстве [11], при выращивании крупного рогатого скота [12]. В защите растений от возбудителей болезней была показана эффективность штаммов B. subtilis в качестве биофунгицидов для культур открытого и защищенного грунта [13, 14], а также в технологии хранения овощей [15].
Цель работы – оценить антагонистическую активность сибирских природных штаммов бактерий рода Bacillus как потенциальную основу биопрепаратов для управления здоровьем животных и растений.

Материалы и методики исследования

Культуры микроорганизмов. Штаммы бактерий-антагонистов патогенной микрофлоры – Bacillussubtilis, Bacillusamyloliquefaciens и Bacilluslicheniformis – были выделены из почвы лесных биоценозов Новосибирской области и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany). Чистые культуры фитопатогенных грибов (Bipolarissorokiniana ВКПМ В-532, BotrytiscinereaВКПМ В-1006, FusariumgraminearumВКПМ В-147, FusariumsolaniВКПМ В-163, Fusariumchlamydosporum ВКПМ В-899, FusariumoxysporumВКПМ В-349, FusariumavenaciumВКПМ В-623) были получены в ВКПМ. Остальные тест-объекты (штаммы Alternariasolani A7 АКТЛ 112, А7 НКЛ 2в, А7 АКТЛ 125 3б, BotrytiscinereaM-01, M-4-2, FusariumsolaniК 6, Phytophthora infestans, расы 3,4 и 1-11) выделены авторами из инфицированных растений, а чистые культуры патогенных бактерий (Candidaalbicans, Citrobacterfreundii, Escherichiacoli, Klebsiellapneumonia, Proteusvulgaris, Pseudomonasaeruginosae, Salmonella entericasubsp. entericaserovarcholeraesuis, Salmonella entericasubsp. entericaserovarenteritidis, Salmonella entericasubsp. entericaserovarparatyphi B, Salmonella entericasubsp. entericaserovartyphimurium, Shigellasonnei, ShigellaflexneriIIa, Staphylococcusaureus) – из патологического органного материала, полученного от павших сельскохозяйственных животных (молодняк крупного рогатого скота, свиньи).

Изучение антагонизма. Антагонистическую активность в отношении патогенов определяли методом перпендикулярных штрихов на чашках Петри с мясо-пептонным агаром (МПА, Meat Infusion Agar (Standart Infusion Agar), HiMedia), и выражали в мм зоны полного угнетения роста патогена [16]. Для оценки антагонистической активности штаммов в отношении C. albicans, с целью формирования одинаково благоприятных условий для роста и развития и патогена, и штамма-антагониста, в МПА добавляли 1% глюкозы (α-D глюкоза (декстроза) моногидрат, Cerestar).  Испытуемый штамм бактерии-антагониста высевали штрихом (полоской) по диаметру чашки Петри с МПА, посевы инкубировали в термостате при температуре (37+0,5)о в течение (48+1) часов. По окончании времени инкубации перпендикулярно к штриху антагониста подсевали тест-культуры патогенов, после чего посевы помещали в термостат при указанной ранее температуре еще на (20+1) часов. Если изучаемый штамм-антагонист оказывал антимикробное действие в отношении изучаемых патогенов, то последние росли на расстоянии от его штриха, которое и являлось количественной мерой антагонистической активности. Антагонистическую активность в отношении фитопатогенов определяли модифицированным методом агаровых блоков и выражали в виде ингибирующей активности [17]. Фитопатогенные грибы выращивали на картофельно-глюкозном агаре. Поверхность агаризованной питательной среды в чашках Петри засевалась бактериальными штаммами для получения равномерных газонов. Чашки инкубировали 48 час при 28о, затем на их поверхность в центр помещали грибные блоки диаметром 1 см, вырезанные из колоний грибов. В контроле среда без внесения бактерий. Измерение диаметров выросших грибных колоний проводилось на 5 сутки сокультивирования при 25о.  Ингибирующую активность вычисляли, исходя из диаметров колоний в контрольном и опытном вариантах по формуле (Дк –До)/Дк, где Дк - диаметр колоний в контроле, До – в опыте, выражая в %.

Данные в таблицах представлены в виде средней арифметической с доверительными интервалами. Статистическая обработка полученных данных выполнена в программе Statsoft STATISTICA for Windows 6.0.

Результаты исследования и обсуждение

Анализ антагонистической активности в отношении патогенных бактерий.
Результаты определения антагонистической активности изученных штаммов в отношении патогенов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Антагонистическая активность бактерий в отношении патогенов, зона угнетения роста, мм

В зависимости от ширины зоны угнетения роста микробных тест-объектов можно выделить высокую (от 11 до 30 мм), среднюю (в пределах 4–10 мм) и слабую антагонистическую активность (до 4 мм).
Наибольшее антагонистическое действие бацилл отмечено в отношении St. aureus.

Таблица 2
Ингибирующая активность бактерий в отношении фитопатогенов, %

Высокой активностью в отношении C. albicans обладали штаммы B. subtilis ВКПМ В-16041, DSM 24613 (далее по тексту Bs-1), B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, DSM 24614 (далее по тексту Ba-1) и B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, DSM 24615 (далее по тексту Ba-2). Остальные штаммы бацилл проявили к данному патогену среднюю антагонистическую активность.
Все штаммы показали наличие бактерицидного действия средней и слабой степени в отношении других использованных в опыте грамотрицательных бактерий – C. freundii, E. coli, K. pneumonia, P. vulgaris, P. aeruginosa, Salmonellasp., Sh. sonnei, Sh. flexneriIIa. Зона угнетения роста составляла в среднем 2–10 мм в зависимости от вида тест-объекта.
Таким образом, все изученные штаммы бактерий B. subtilis, B. amyloliquefaciensи B. licheniformis подавляли рост патогенных бактерий, хотя и в различной степени.

Анализ антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов
Штаммы бактерий-антагонистов проявили ингибирующие свойства в отношении большинства использованных в опыте фитопатогенов (табл. 2).
На возбудителя альтернариоза A. solani наибольшее ингибирующее действие оказали штаммы B. amyloliquefaciens Ba-1 и Ba-2, B. licheniformis ВКПМ В-10561, DSM 24609 (далее по тексту Bl-1), иB. subtilis Bs-1. В подавлении роста возбудителя корневых гнилей B. sorokiniana высокую активность проявили штаммы B. subtilis Bs-1, B. amyloliquefaciens Ba-1и Ba-2. Эти же штаммы были максимально активными по сравнению с остальными по отношению к возбудителю серой гнили растений B. cinerea. В то же время установлено, что штаммы B. licheniformis не подавляли роста B. cinerea (штамм ВКПМ В-1006). Против фитопатогенных грибов рода Fusarium и возбудителя фитофтороза пасленовых культур Ph. infestans все изученные нами бактерии Bacillusspp. показали высокий уровень ингибирующей активности. У бактерий B. licheniformis Bl-1; ВКПМ В-10562, DSM 24610 (далее по тексту Bl-2) и ВКПМ В-10564, DSM 24612 (далее по тексту Bl-4) отсутствовала антагонистическая активность в отношении F. solani ВКПМ В-163.
Проведенные исследования показали, что помимо бактерицидного действия, которое штаммы B. subtilis, B. amyloliquefaciens и B. licheniformis оказывали на патогенные бактерии, они проявляют ингибирующую активность в отношении фитопатогенных грибов. Ряд авторов указывал на подобное антибактериальное и фунгистатическое действие спорообразующих бактерий [18–21]. Как отмечено выше, это связано с тем, что перечисленные бактерии в процессе жизнедеятельности выделяют антимикробные вещества широкого спектра действия [22, 23]. Поэтому спорообразующие бактерии применяют в качестве действующего начала как лекарственных препаратов [24, 25], так и экологически безопасных средств защиты растений от болезней [26, 27].
Нами установлено наличие антагонизма изученных штаммов бактерий рода Bacillus в опытах invitro в отношении бактерий-возбудителей болезней животных и человека – C. freundii, E. coli, K. pneumonia, P. vulgaris, P. aeruginosa, Salmonellasp., Sh. sonnei, Sh. flexneri IIa и St. aureus, C. albicans. Что касается антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов, то добавление изученных штаммов в питательную среду подавляло рост опасных возбудителей болезней растений A. solani, B. sorokiniana, Ph. infestans и грибов рода Fusarium в большей или меньшей степени в зависимости от штамма тест-микроорганизма. Для одного из использованных в эксперименте штаммов – B. cinerea ВКПМ В-1006 – не выявлено ингибирующего действия со стороны бактерий-антагонистов B. licheniformis. Наши результаты согласуются с данными, полученными другими авторами в работах, касающихся патогенных бактерий Corynebacteriumdiphteriae, St. aureus, Streptococcushaemolyticus, P. aeruginosa[28] и фитопатогенных грибов [29, 30]. Так, Н.И. Габриэлян с соавторами [28] показали, что штамм бактерии B. subtilis, входящий в состав препарата споробактерин, обладает высокой антагонистической активностью в отношении стафилококков (St. aureus, St. epidermidis, St. saprophyticus), дрожжеподобных грибов Candidaspp.и энтерококков (Enterococcusfaecium). В то же время, авторы отмечают, что среди изученных штаммов другого вида энтерококка – E. faecalis – лишь 50% были чувствительны к штамму-антагонисту. Авторы указывают, что изученный ими штамм B. subtilis эффективно подавлял лишь 36,8% штаммов патогенных бактерий, среди которых были E. coli, Klebsiellaspp., Serratiaspp. и другие, тогда как изученные в нашей работе штаммы бактерий-антагонистов B. subtilis, B. amyloliquefaciensи B. licheniformis в 100% случаев ингибировали перечисленных патогенов.
Продемонстрировано наличие у B. subtilis ингибирующей активности по отношению к таким фитопатогенным грибам, как A. alternata, B. cinerea, B. sorokiniana, Cladosporiumsp., F. avenacium, F. oxysporum и другим [31]. При этом отмечено, что некоторые из изученных авторами штаммов обладали 100%-й ингибирующей активностью в отношении B. cinerea и F. oxysporum, чего не наблюдалось в наших экспериментах.
Наблюдающиеся различия в оценке антагонистической активности бактериальных штаммов, представленные в разных работах, могут быть связаны с разным географическим происхождением изучаемых культур [32]. Различия в антагонистической активности против штаммов патогенов одного вида можно объяснить вариабельным составом пептидогликана бактериальной клетки, который является регулятором взаимоотношений в системе «прокариот-прокариот», а также регулятором внутриродового и межродового антагонизма в условиях межмикробных взаимодействий [33].

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований был выявлен антагонистический потенциал природных сибирских штаммов бактерий рода Bacillus. Bсе изученные штаммы бактерий-антагонистов B. subtilis, B. amyloliquefaciensи B. licheniformis проявили бактерицидное и фунгистатическое действия invitro на чистых культурах патогенных бактерий и фитопатогенных грибов. Подавление штаммами-антагонистами роста патогенов, вызывающих болезни сельскохозяйственных животных и растений перспективно для создания биопрепаратов, обеспечивающих получение экологически безопасной продукции животноводства и растениеводства, что важно для решения проблем здорового питания населения.

Литература

1.Price N.P.J., Rooney A.P., Swezey J.L., Perry E., Cohan F. M. Mass spectrometric analysis of lipopeptides from Bacillus strains isolated from diverse geographical locations // FEMS Microbiol Lett. 2007. №. 271. P. 83–89.
2. Balaban N.P., Mardanova A.M., Malikova L.A., Shamsutdinov T.R., Ilinsky O.N., Sharipova M.R., Rudenskay G.N. Isolation and characterization of Bacillus amyloliquefaciens H2 glutamyl endopeptidase that is secreted in stationary phase of culture growth // Annals Microbiol. 2008. Vol. 58. № 4. P. 697–704.
3. Бала С.С. Антагонистическая активность пробиотиков на основе аэробных спорообразующих бактерий // Успехи современного естествознания. 2004. № 12. С. 84.
4. Chiou A.L., Wu W.S. Formulation of Bacillus amyloliquefaciens B190 for control of lily grey mould (Botrytis elliptica) // J. Phytopathol. 2003. Vol. 151. № 1. P. 13–18.
5. Chebotar V.K., Makarova N.M., Shaposhnikov A.I. Antifungal and phytostimulating characteristics of Bacillus subtilis Ch-13 rhizospheric strain, producer of biopreparations // Appl. Biochem. Microbiol. 2009. № 4. P. 419–423.
6. Пушкарев А. М., Туйгунова В. Г., Зайнуллин Р.Р., Кузнецова Т.Н., Габидуллин Ю. З. Использование антагонистических свойств бактерий Bacillussubtilis в терапии госпитальной инфекции мочевых путей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2007. № 2. C. 90–93.
7. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журнал микробиологии. 2004. № 3. C. 84–92.
8. Лазовская А.Л., Гришина Н.В., Воробьева З.Г., Слинииа К.Н., Кульчицкая М.А., Васильева Е.А. Антагонистическая активность споровых пробиотиков и влияние на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза // Вестн. Росс. Ун-та дружбы народов. Сер. медицина. 2010. №1. C. 18–24.
9. Ушакова Н.А., Котенкова Е.В., Козлова А.А., Нифатов А.В. Изучение механизмов пробиотического действия штамма Bacillussubtilis 8130 // Прикл. Биохим. Микробиол. 2006. Т.42. № 3. С. 285–291.
10. Федорова М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.П., Кириллина В.И. Применение пробиотиков из штаммов бактерий Bacillussubtilis для получения здоровых поросят // Зоотехния. 2011. №2. C. 16–17.
11. Беркольд Ю.И., Иванова А.Б. Влияние пробиотических препаратов на основе Bacillus subtilis на физиологические показатели роста цыплят-бройлеров // Сиб. вестн. с.-х. науки. 2006. №4. С. 45–48.
12. Хазиахметов Ф.С., Башаров А.А., Нугуманов Г.О. Оценка эффективности комплексного препарата пробиотика с биологически активными веществами при выращивании телят // Проблемы биологии продуктивных животных. 2011. №2. С. 106–109.
13. Хайруллин Р. М., Егоршина А. А., Лукьянцев М. А., Уразбахтина Н. А., Иргалина Р. Ш., Сахабутдинова А. Р. Биологические особенности эндофитных штаммов Bacillussubtilis как перспективной основы новых биопрепаратов // Аграрная Россия. 2011. №1. С. 49–53.
14. Пусенкова Л.И., Глез В.М., Зейрук В.Н., Деревягина М.К., Максимов И.В. Биопрепараты для защиты картофеля от болезней // Защита и карантин растений. 2010. №10. С. 26–28.
15. Рудаков В.О., Морозов Д.О., Седых А.Н. Способ, позволяющий сократить потери сахарной свеклы в кагатах// Защита и карантин растений. 2010. №6. С. 66–67.
16. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М. : МГУ, Наука, 2004. 528 с.
17. Соколова М.В. Хитинолитическая и антигрибная активность трех штаммов бактерии рода Serratia // Современная биотехнология в решении проблем защиты растений. СПб. 1995. С. 214–224.
18. Волков М.Ю., Ткаченко Е.И., Воробейников Е.В., Синица А.В. Метаболиты Bacillussubtilis как новые перспективные пробиотические препараты // Ж. микробиол. Эпидемиол. и иммунобиол. 2007. №2. С. 75–80.
19. Бойко Н.В., Туряница А.И., Попович Е.П., Вьюницкая В.А. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella // Микробиол. ж. 1989. №1. С. 87–91.
20. Актуганов Г. Э., Мелентьев А.И., Кузьмина Л. Ю., Галимзянова Η. Ф., Широков А. В. Хитинолитическая активность бактерий BacillusCohn. – антагонистов фитопатогенных грибов // Микробиология. 2003. Т. 72. №3. С. 356–360.
21. Оришак Е.А., Бойцов А.Г., Нилова Л.Ю. Изучение антагонистической активности споросодержащих пробиотиков // Профилактическая и клиническая медицина. 2009. №3. С. 199–202.
22. Кудрявцева, В.А., Осадчая А.И., Сафронова Л.А. Аэробы рода Bacillusкак источник продуцентов литических ферментов // Биотехнология. 2004. №4. С. 24–33.
23. Михайлова H.M, Блинкова Л.П, Гатауллин А.Г. Биологические свойства новых изолятов Bacillussubtilis // Ж. Микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 2007. №4. С. 41–46.
24. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайдеров А.А. Споровые пробиотики // Журн. микробиол. 2003. № 3. С. 113–119.
25. Никитенко В.И. Медицинский институт Оренбурга представляет препарат споробактерин // JAMA. 1991. Vol. 64. № 1. P. 31.
26. Кузьмина Л.Ю., Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф., Свешникова Е.В., Мелентьев А.И. Эффективность бактериальных препаратов при защите растений яровой пшеницы от твердой головни // С.-х. биология. 2003. №5. С. 69–73.
27. Белов Л.П., Шкаликов В.А., Дунаева Ю.С. Возможности использования препарата на основе Bacillussubtilis и Bacilluslicheniformis в растениеводстве // АГРО XXI. 2008. № 4–6. С. 35.
28. Габриэлян Н.И., Давыдов Д.С., Горская Е.М., Спирина Т.С., Осипова И.Г. Антагонизм invitro споробактерина в отношении нозокомиальных штаммов микробов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2008. № 6. С. 12–18.
29. Agarry O.O., Akinyosoye F.A., Adetuyi F.C. Antagonistic properties of microogranisms associated with cassava (Manihot esculenta Crantz) products// African J. Biotechnol. 2005. Vol. 4. P. 627–632.
30. Chan Yiu-Kwok , Savard M.E., Reid L.M., Cyr T., McCormick W.A., Seguin C. Identification of lipopeptide antibiotics of a Bacillus subtilis isolate and their control of Fusarium graminearum diseases in maize and wheat// BioControl. 2009. Vol. 54. P. 567–574.
31. Минина Т.С., Захарова Р.Ш., Уразбахтина Н.А., Хайруллин Р.М. Новые эндофитные штаммы Bacillussubtilis как основа биофунгицидов // Вестник Казанского ГАУ. 2009. № 2. С. 118–123.
32. Beric T., Kojic M., Stancovic S., Topisirovic L., Degrassi G., Myers M., Venturi V., Djordje F. Antimicrobial Activity of Bacillus sp. natural isolates and their potential use in the biocontrol of phytopathogenic bacteria // Food Technol. Biotechnol. 2012. Vol. 50. P. 25–31.
33. Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности Staphylococcusaureus при межмикробных взаимодействиях // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2011. № 3 (15). С. 56–66.

Поступила в редакцию 01.10.2013 г.

Anastasya A. Lelyak1, Margarita V. Shternshis2

1Research Center, Ltd, scientific town Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; 2Novosibirsk State Agrarian University, Russia

ANTAGONISTIC POTENTIAL OF SIBERIAN STRAINS OF BACILLUS SPP. TOWARD AGENTS CAUSED ANIMAL AND PLANT DISEASES
Key words:Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, antagonistic activity, pathogenic bacteria, phytopathogenic fungi.