На правах рукописи

Малярчук Анастасия Александровна 

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА
METARHIZIUM ANISOPLIAE(METCH.) SOR. ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ЧИСЛЕННОСТИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА

03.00.32 – биологические ресурсы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2009 

Работа выполнена на кафедре биологической защиты растений в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:	- доктор биологических наук, профессор Штерншис Маргарита Владимировна.
Официальные оппоненты:	- доктор сельскохозяйственных наук, профессор Коробов Виктор Александрович, Новосибирский государственный аграрный университет; - доктор биологических наук Данилова Альбина Афанасьевна, Сибирский научно-исследовательский институт земледелия и химизации СО РАСХН.
Ведущая организация:	Томский государственный университет.

Защита состоится «09» апреля 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.048.04 при Новосибирском государственном аграрном университете по адресу: 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» (www.nsau.edu.ru).

Автореферат разослан «21» февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета                      Князев С.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований.

Среди природных ресурсов регуляции численности вредных видов насекомых, повреждающих сельскохозяйственные и лесные культуры, особого внимания заслуживают энтомопатогенные грибы. Они обитают в почве, на растениях, в телах насекомых. Периодически эти биологические агенты вызывают вспышки массовых заболеваний насекомых, что приводит к резкому подавлению их численности, сохраняя урожай. Однако возникновение эпизоотий в большой степени зависит от абиотических и биотических факторов внешней среды и случается не столь часто, как это требуется для подавления численности насекомых-фитофагов, являющихся конкурентами человека в потреблении растительной пищи. Поэтому более важна интродукция выделенных из природы энтомопатогенных грибов в агроценозы с целью сохранения урожая от фитофагов. Первым в мире энтомопатогенный гриб Metarhizium anisopliae(Metch.) Sor. выделил из природы и предложил размножить  для  внесения  в  агроценозы  известный  российский  ученый  И.И. Мечников (1902). Этим было положено начало микробиологическому методу регуляции численности насекомых, распространившемуся по всему миру. Впоследствии энтомопатогенные грибы, относящиеся к отделам Deuteromycota и Zygomycota, стали основой биопрепаратов, предложенных для биологического контроля насекомых в разных странах. На основе природных штаммов энтомопатогенных грибов в нашей стране были разработаны биопрепараты Боверин на основе гриба Beauveria bassiana Bals. Vuil., Вертициллин на основе Verticillium lecanii Nees. (Lecanicillium sp.), Пириформин на основе  Entomophthora piryformis (Petch) Hall et Bell (Conidiobolusthromboides) и другие.

Таким образом, энтомопатогенные грибы являются биологическим ресурсом, вовлекаемым в хозяйственную деятельность, поддерживающим биосферный баланс и имеющим оздоровительное значение (замена токсичных синтетических инсектицидов на биологические, основанные на изъятых из природы агентов). Современная трактовка понятия «биологические ресурсы» ставит задачи расширения биоресурсной базы и развития биотехнологий, оптимизирующих управление ресурсами природных и искусственно созданных биосистем.

Что касается препарата на основе гриба  Metarhizium anisopliae, предложенного И.И. Мечниковым, то его производство было прекращено в начале ХХ в. и с тех пор в России нет энтомопатогенного препарата на основе этого гриба. К возможным причинам неудач при разработке и применении препарата относятся недооценка изменчивости штаммов, отсутствие методов повышения биоресурса гриба,  как путем усиления вирулентности, так и преодоления негативного влияния факторов окружающей среды. В то же время  реализация биологического ресурса Metarhizium anisopliae актуальна для подавления численности особо опасных вредителей сельского хозяйства. Среди особо опасных фитофагов в последние годы в Сибири широкое распространение получил колорадский жук. Подавление численности этого вредителя биологическими  препаратами, безопасными для окружающей среды, является чрезвычайно актуальной задачей. Поэтому исследования по биоресурсному потенциалу гриба, включающие селекцию природных штаммов, оценку вирулентности гриба и его продуктивности, необходимы для разработки биопрепарата на его основе.

Цель работы – изучить возможности повышения биоресурсного потенциала гриба Metarhizium anisopliae и его рационального использования как основы для разработки биопрепарата, подавляющего численность колорадского жука.

Задачи исследований:

1.     Изучить гетерогенность популяций природных штаммов гриба Metarhizium anisopliae по культуральным, морфологическим, биохимическим и вирулентным признакам.

2.     Оценить вирулентность природных и полученных методом селекции на основе спонтанной изменчивости штаммов гриба по отношению к насекомым.

3.     Определить продуктивность штаммов в разных условиях выращивания биомассы.

4.     Оценить устойчивость исходных штаммов и морфоваров гриба к абиотическим факторам (температуре и ультрафиолетовому облучению).

5.     Выявить защитный эффект антиоксидантов при хранении и ультрафиолетовом облучении гриба M. anisopliae.

6.     Определить эффективность энтомопатогенного гриба в подавлении численности колорадского жука в полевых условиях.

Защищаемые положения:

1.     Наличие спонтанной изменчивости природных изолятов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae позволяет получать высокоактивные и стабильные формы гриба путем отбора по признакам вирулентности и ферментативной активности.

2.     Повышение биоресурса гриба обеспечивается методами его селекции, оптимизации условий культивирования, учетом влияния абиотических факторов, в первую очередь ультрафиолетового облучения.

3.  Штамм гриба M. anisopliae p-72-1, обладающий наиболее высокими показателями протеазной, эстеразной, липазной, амилазной и хитиназной активностей и наибольшей биологической активностью может быть использован в качестве основы препарата для биологического контроля колорадского жука.

Научная новизна.

Впервые детально изучено влияние спонтанной изменчивости природных штаммов энтомопатогенного гриба M. anisopliae, выделенных из двух видов насекомых: колорадского жука (Leptinotarsa decemlineataSay.) и реликтового усача (CallipogonrelictusSaw.), на морфологические (структура, скорость роста колоний, размер конидий) и биохимические (ферментативная активность) признаки. Наличие спонтанной изменчивости у природных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р служит базовым фактором управления их биоресурсом. Установлены критерии оценки высоковирулентных и продуктивных штаммов, основанные на биотестах и определении их ферментативной активности. Определено влияние абиотических факторов - температуры и ультрафиолетового света – на сохранность и биологическую эффективность штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов в процессе длительного хранения биомассы. Продемонстрировано негативное влияние ультрафиолетового облучения на биоресурс гриба M. anisopliae. Разработана технология производства биомассы энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (штаммов р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов) с целью дальнейшего использования биологического ресурса гриба в открытых экосистемах в качестве агента регуляции численности насекомых-фитофагов. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку – опасному вредителю картофеля.

Практическая значимость.

Для селекции высокоактивных и стабильных форм из естественной популяции гриба M. anisopliae предложен метод ступенчатого отбора из моноспоровых рассевов энтомопатогена. Отбор штамма по морфологическим и биохимическим критериям позволяет повысить биологический ресурс гриба как агента биологической регуляции насекомых. Рекомендуется использовать штамм Metarhizium anisopliae р-72-1 как основу биопрепарата для биологического контроля колорадского жука.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены:

-   на Международной научно-практической конференции молодых ученых, (Новосибирск, 2006);

-   на Международной научно-практической конференции  (Костинброд, Болгария, 2006);

-   на 40 коллоквиуме по патологии насекомых и микробному контролю (Квебек, Канада, 2007);

-   на Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции (Краснодар, 2008).

Публикации по теме диссертации.

Всего по теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы.  

Диссертация состоит из введения, четырех глав, списка литературы и приложения. Работа изложена на 132 страницах, содержит 14 рисунков, 15 таблиц. Список литературы включает 205 источников, из них 107 – на иностранном языке.

Благодарности.

Автор выражает глубокую  благодарность научному руководителю, доктору биологических наук, профессору М.В. Штерншис, директору ООО Научно – производственная фирма «Исследовательский центр» А. И. Леляк за предоставление лабораторной базы для проведения опытов и ценные замечания,  а также кандидату биологических наук В. В. Сереброву за помощь в проведении экспериментов и  в обсуждении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

В работе были использованы природные штаммы энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. р-72 и 85-69р. Штаммы были получены из коллекции культур Института систематики и экологии животных СО РАН. 

В качестве тест–объектов для оценки биологической эффективности штаммов M. anisopliae в лабораторных условиях использовали гусениц пчелиной огневки Galleria melonella лабораторной популяции и личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata природной популяции.

С целью наработки спорово – мицелиальной массы гриба использовали методы глубинного культивирования и культивирования на стерильном плотном субстрате (пшене).

В экспериментах по определению сроков хранения биомассы и изучению влияния ультрафиолетового облучения (УФО) были использованы антиоксиданты ионол и тирозол, предоставленные Институтом органической химии СО РАН.

Для селекции гриба использовали метод спонтанной изменчивости. Для оценки стабильности морфоваров их культивировали в течение пяти вегетативных пассажей. Морфологию вновь полученных изолятов оценивали по окраске и форме колоний, размерам колоний и скорости роста мицелия на питательных средах. Кроме этого, в качестве показателей изменчивости изучали изменения ферментативной активности полученных морфологических вариантов и их вирулентности.

Для проведения пассажей штаммов р-72 и 85-69р энтомопатогенного гриба M. anisopliae  через живой организм использовали гусениц пчелиной огневки Galleria mellonella.

Эстеразную активность штаммов гриба определяли спектрофотометрическим методом. Протеазную активность оценивали по гидролизу казеина на среде, содержащей 0,5 % стерильного обезжиренного молока. Амилазную активность оценивали по гидролизу водорастворимого крахмала на среде, содержащей 0,2 % данного субстрата. Для определения липазной активности использовали две среды: с твином – 80 и оливковым маслом. Хитиназную активность оценивали на среде с коллоидным хитином.

Для оценки антиоксидантов как протекторов от УФО в нативную суспензию спор гриба добавляли ионол и тирозол в количестве, необходимом для получения концентрации 0,15 %.  Облучение вели в стационарном состоянии в темном боксе ультрафиолетовым светом. О влиянии УФО на каждый штамм и о защитных свойствах добавленных антиоксидантов судили по выживаемости спор. Для определения сроков хранения экспериментальных препаратов на основе M. anisopliae использовали две препаративные формы: жидкую биомассу и сухой споровый порошок. В качестве возможных защитных соединений, способных увеличить сохранность штаммов р-72 и 85-69р энтомопатогенного гриба M. anisopliae и их морфологических вариантов, использовали антиоксиданты ионол и тирозол. Образцы хранили при температурах:  -20 ⁰С, 6 ⁰С, 20 ⁰С. Частоту высевов корректировали в соответствии с получаемыми результатами. Определяли жизнеспособность спор и биологическую активность препаратов. Заражение производили путем нанесения суспензии спор гриба исследуемых концентраций на личинок. Учет гибели насекомых проводили ежедневно, начиная с первых суток после инокуляции.

Для оценки биологического ресурса гриба M. anisopliae как агента биологического контроля численности колорадского жука проводили полевые опыты на посадках картофеля в хозяйстве ЗАО “Шигаевское” Сузунского района  Новосибирской области в 2005 – 2007 гг. В полевом эксперименте использовался картофель сорта Романо и водные суспензии конидий энтомопатогенного гриба M. anisopliae  в двух концентрациях:1x10⁷ и 5x10⁷ КОЕ/мл. Повторность 4-кратная. Площадь учетной делянки 100 м². Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 3, 5, 7 и 10 сутки. Биологическую эффективность оценивали по формуле Аббота.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Факторы вирулентности энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae, определяющие его биологический ресурс

Энтомопатогенные грибы как природные агенты регуляции численности насекомых – фитофагов являются важным биологическим ресурсом, обеспечивающим сохранение биоразнообразия как в естественных биоценозах, так и при использовании их как биологического средства защиты растений в агроценозах. Для рационального использования энтомопатогенного гриба  M. anisopliae требуются исследования, которые позволят повысить его ресурс как природного агента регуляции численности фитофагов. В этом отношении обращает на себя внимание явление спонтанной изменчивости, наблюдаемое у энтомопатогенных грибов. В ряде работ было показано, что одним из возможных механизмов, обусловливающих изменение вирулентных свойств энтомопатогенных грибов, может быть спонтанная изменчивость (Алешина и др., 1972; Хашимова; Тансыкбаева, 1985; Митина и др., 1997; Огарков, Огаркова, 2000; Гештовт, 2002; Frigo, Azevedo, 1986). Изучение этого явления необходимо для разработки методологических основ селекции штаммов и способов сохранения их свойств в течение длительного времени. С другой стороны, процессы спонтанной изменчивости происходят и в природных агроценозах, поэтому изучение спонтанной изменчивости может приблизить нас к пониманию механизмов возникновения эпизоотий в популяциях насекомых, во время которых наиболее ярко проявляется биологический ресурс гриба, играющего важную роль в сохранении биоразнообразия.

В связи с этим нами были проведены эксперименты по изучению в лабораторных условиях морфологических, биохимических и вирулентных свойств природных штаммов энтомопатогенного гриба M. anisopliae с целью разработки критериев отбора наиболее вирулентных изолятов для управления этим биоресурсом.

1.1 Выделение первичных спонтанных изолятов и изучение их морфологии

Для подтверждения существования спонтанной изменчивости у энтомопатогенного гриба M. anisopliae мы провели клоновый отбор изолятов от двух природных штаммов: р-72 и 85-69р. Полученные варианты были разделены по морфологии колоний при росте на питательных средах Сабуро и Чапека на несколько групп.  В ходе работы нами  выделено и изучено 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-69р. Анализ культурально – морфологических особенностей выделенных изолятов показал, что штаммы энтомопатогенных грибов дифференцируются на два типа морфоваров. Морфовары исходного штамма р-72 обозначены нами как р-72-1 и р-72-2, штамма 85-69р  как 85-69p-1 и 85-69p-2.

Штамм р-72-1 – поверхность колонии порошистая, цвет воздушного мицелия темно – зеленый с идущими от центра колонии к периферии кольцами зелено – желтого цвета, цвет субстратного мицелия  - желто – зеленый, .воздушный мицелий развит слабо, граница колонии ровная, центр приподнятый в виде бугорка мицелия пепельно – серого цвета. Спороношение обильное.

Штамм р-72-2 – поверхность колонии шероховатая, пушистая, по периферии порошистая, консистенция мягкая, цвет воздушного мицелия желтовато – бледно - серый, воздушный мицелий развит хорошо, колония пушистая, граница колонии ровная, центр колонии плоский. Спороношение слабое.

Штамм 85-69р-1 – колонии зеленовато-серые или желтовато-серые, поверхность порошистая, с обильным спороношением.

Штамм 85-69р-2 – поверхность колонии полностью покрыта белым или желтоватым ватообразным мицелием. Таким образом, было выделено два основных типа колоний - с пушистой и порошистой структурой.

Было показано, что 55 % моноспоровых изолятов штамма р-72 принадлежит к типу р-72-1, а 45 % - к типу р-72-2. Соотношение морфоваров для штамма 85-69р составило 46 и 54 %, соответственно. Все морфовары оказались стабильными и сохраняли исходные характеристики при многократных пересевах на питательных средах. Таким образом, выделенные варианты различались структурой, цветом колоний и интенсивностью спороношения. Подобные данные были получены рядом авторов, изучавших спонтанную изменчивость энтомопатогенных и фитопатогенных грибов (Кузнецов, Новикова, 1967; Лохвицкая, 1968; Шмотина, Горленко, 1970; Рудакова, Лепихова, 1974).

В качестве критериев для дальнейшего изучения изолятов были выбраны: размер конидий, скорость роста на различных питательных средах,  а также ферментативная активность.

Результаты определения размеров конидий на питательных средах представлены на рисунке 1.

Для большинства морфологических вариантов штаммов р-72 и 85-69р не было отмечено статистически достоверных различий между средними размерами конидий. Однако конидии морфовара р-72-1 достоверно отличались от родительского штамма р-72 по длине и ширине.

При оценке различий в скорости роста колоний наибольшей интенсивностью роста обладал вариант p-72-1, в то время как родительский штамм p-72 и второй вариант p-72-2 отставали в росте в среднем на 6 дней. Среди вариантов штамма 85-69р наибольшей скоростью роста обладал вариант 85-69р-2, от которого родительский штамм отставал по времени на 4 дня.

Таким образом, среди отобранных морфологических вариантов наиболее быстрорастущими оказались варианты p-72-1 (исходный штамм p-72) и 85-69р-2 (исходный штамм 85-69р).

Рисунок 1. Размер конидий штаммов и морфоваров M. anisopliae 

1.2 Ферментативная активность изолятов

Рядом авторов показано, что вирулентность энтомопатогенных грибов тесно связана с  ферментативной активностью (Павлюшин, 1979; Павлюкова с соавт., 1998;  Rosato, Messias, Azevedo, 1989; McHenry, 1996;). Этот биохимический критерий важен для оценки штаммов и морфоваров энтомопатогенного гриба как биологического ресурса.

Нами была изучена ферментативная активность отобранных вариантов и исходных штаммов энтомопатогенного гриба M. anisopliae. Результаты представлены в таблице 1.

Результаты показали, что морфологически разные варианты отличаются и по ферментативной активности. Среди них есть морфовары как с повышенной по отношению к родительским штаммам, так и с пониженной ферментативной активностью. Так, например, более высокие показатели по всем видам ферментативной активности оказались у варианта р-72-1 по сравнению с р-72: протеолитическая активность превышала аналогичную родительского штамма в 2,4 раза, эстеразная активность – в 2,1 раза, липазная – в 3,7 раза, амилазная – в 1,4 и хитиназная – в 1,3 раза.  Следует отметить, что штаммы и морфовары с большей ферментативной активностью оказались более вирулентными нежели те,

Таблица 1. Ферментативная активность штаммов и морфологических вариантов M. anisopliae

Штамм	Смертность личинок колорадского жука, %	Ферментативная активность
		Проте-азная*	Эсте-разная**	Липаз-ная*	Ами-лазная*	Хити- назная**
р-72	90	5	0,381	3	17	61
р-72-1	97	12	0,784	11	24	80
р-72-2	52	4	0,107	3	8	23
85-69р	47	4	0,082	3	10	25
85-69р-1	41	7	0,079	6	12	20
85-69р-2	43	4	0,049	4	9	21
НСР05	47,4	2,900	0,052	2,800	3,700	18,500
r	-	0,73	0,92	0,66	0,89	0,97

Примечание: * - зона лизиса специфического субстрата, мм; ** - единицы активности в 1 мл культуральной жидкости.

ферментативная активность которых была ниже, что подтверждает важную роль ферментов в патологическом процессе, вызываемом M. anisopliae. Корреляционный анализ показал наличие высокой (с коэффициентом выше 0,80) положительной корреляции эстеразной, амилазной и хитиназной активностей с вирулентностью изученных штаммов и средней (с коэффициентами 0,66 и 0,73) положительной корреляции липазной и протеазной активностей с вирулентностью. Так, морфовар р-72-1, вызывающий наибольший процент смертности личинок колорадского жука, обладал максимальной среди проанализированных штаммов продукцией экстрацеллюлярных ферментов изученных групп. Штамм 85-69 и его морфовары 1 и 2 имели промежуточные по числовому значению показатели ферментативной активности, равно как и уровень вирулентности, находившийся в пределах (41-47,4) %.

1.3 Влияние абиотических факторов на жизнеспособность культуры гриба M. anisopliae

Энтомопатогенные грибы, являясь компонентом природных биоценозов, подвергаются влиянию различных абиотических факторов окружающей среды (температуры, влажности, солнечной радиации и др.). Для повышения биологического ресурса микроорганизмов, используемых в качестве регуляторов численности насекомых, необходимо защищать их от отрицательного влияния факторов окружающей среды, таких, как солнечное излучение и окислительные процессы (Зенков с соавт., 2001, David et al., 1986).  

1.3.1 Жизнеспособность культуры гриба при хранении в жидком и сухом виде

Для изучения сохранности культур гриба M. anisopliae в жидком и сухом виде при различных температурных условиях использовали морфологический вариант р-72-1, показавший наибольшую ферментативную активность.  Учитывая отсутствие постоянных оптимальных температур в полевых условиях для выживания энтомопатогенного гриба M. anisopliae при изучении  сохранности в лабораторном эксперименте были взяты граничные положительные и отрицательные температурные значения 20 ⁰С и -20 ⁰С, а также промежуточная средняя температура 6 ⁰С. В качестве контроля использовали жидкую и сухую культуру гриба, размноженную на питательных средах. Общий срок хранения культур при заданных температурах составил 20 месяцев. Для изучения возможности продления срока хранения в качестве защитных компонентов использовали антиоксиданты ионол и тирозол.

В результате показано, что ионол и тирозол в концентрациях 0,15 и 0,3 %  перспективны для использования в качестве веществ, позволяющих сохранить жизнеспособность спор гриба  M. anisopliae в суспензии в условиях низких отрицательных температур (–20 ⁰С). При хранении суспензии спор гриба в условиях комнатной (20 ⁰С) температуры наиболее эффективным для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30 %.

В отличие от суспензии, споры в сухом виде имеют большую жизнеспособность. Так, в процессе хранения образцов сухой споровой массы при температурах 6, - 20 и 20 ⁰С их жизнеспособность оставалась на одном уровне в контроле и опытных вариантах. Следовательно, добавление антиоксидантов нецелесообразно, если препарат предполагается хранить при указанных температурах в сухом виде.

1.3.2 Выживаемость спор гриба под действием УФ-облучения

Солнечная радиация, главным образом ультрафиолетовое излучение, самый мощный фактор инактивации энтомопатогенных грибов при сохранении их во внешней среде.  Результаты опытов по влиянию ультрафиолетового облучения на выживаемость конидий M. anisopliae показали, что при жестком модельном УФО жизнеспособность конидий природных штаммов и их морфоваров резко снижается. Так, через  1 мин после УФО осталось около 60 % жизнеспособных конидий для штамма 85-69р и его морфоваров (рис. 2) и около 80 % жизнеспособных конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Через 3 мин в первом случае произошло снижение жизнеспособности конидий не менее чем в 5 раз, а во втором – не менее чем в 2,5 раза по сравнению с исходными значениями. Почти не осталось жизнеспособных спор через 5 и 7 мин соответственно для штаммов 85-69р и р-72. Это означает, что восприимчивость к УФО более высока для штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению с р-72 с соответствующими морфоварами. С другой стороны, выявились некоторые различия в устойчивости исходных штаммов и морфоваров с разной структурой колоний. Так, через 1 мин после УФО осталось 80 % жизнеспособных конидий морфовара р-72-1 с пушистой структурой и лишь 63 % морфовара р-72-2 с порошистой структурой.

 

 

Рисунок 2. Выживаемость конидий M. anisopliae при облучении суспензии ультрафиолетовыми лучами без добавок

Рисунок 3. Выживаемость конидий M. anisopliae при облучении суспензии ультрафиолетовыми лучами с добавлением 0,15 % тирозола

В случае со штаммом 85-69р и его морфоварами эти различия несущественны. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что восприимчивость к ультрафиолетовому свету более высока для штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению со штаммом  р-72 с соответствующими морфоварами. Это явление можно объяснить тем, что конидии штамма р-72 и его морфоваров насыщены темным меланиновым пигментом, что, как известно, является основной причиной высокой устой­чивости пигментированных микроорганизмов к ультрафиолетовому  излучению.

При добавлении в суспензию антиоксиданта наблюдали полный или частичный защитный эффект от УФО. Так, для M. anisopliae 85-69р (рис.2, 3) через 1 мин облучения без антиоксиданта осталось 60 % жизнеспособных спор, а при добавлении тирозола наблюдали практически полное сохранение жизнеспособности спор. Для р-72-1 с добавлением антиоксиданта через 7 мин после УФО сохранялось в 10 раз больше спор, чем  при облучении без добавления антиоксиданта.

Таким образом, тирозол и ионол в концентрации 0,15 % одновременно могут выполнять две функции: не только увеличивать срок хранения энтомопатогенного гриба M. anisopliae, но и служить протекторами от УФ-облучения.

2. Воспроизводство и рациональное использование энтомопатогенного гриба M. anisopliae как агента регуляции численности колорадского жука

2.1 Оптимизация наработки биомассы гриба как основы биологического препарата

Воспроизводство энтомопатогенных грибов предполагает разработку способов их культивирования  (Огарков, 1979; Третьяков, 1995). Нами проведено сравнение двух способов получения биомассы: жидкостной ферментации на питательной среде  и выращивания культуры гриба на стерильной смеси пшена с отрубями.

В результате проведенных экспериментов установлено, что метод культивирования на пшене не уступает методу глубинного культивирования гриба M. anisopliae по продуктивности спорово – мицелиальной массы и титру жизнеспособных конидий, хотя является более трудозатратным. Однако при разработке технологии производства инсектицидных биопрепаратов на основе грибов наиболее значимым параметром является сохранение жизнеспособности действующего начала препарата и его биологической активности в течение определенного времени хранения.  Спорово – мицелиальная масса, полученная методом жидкостного культивирования, имеет весьма низкую сохранность и быстро (в течение 3 месяцев) снижает свою биологическую активность на 2 – 3 порядка. В связи с чем второй апробированный способ культивирования (на стерильном растительном субстрате) является более целесообразным для наработки биомассы энтомопатогенного гриба M. anisopliae.

2.2 Оценка инсектицидной активности природных штаммов и морфоваров M. anisopliae

Рациональное использование биологического ресурса M. anisopliae в качестве природного регулятора численности фитофагов требует оценки его инсектицидной активности. Для отбора наиболее вирулентного изолята нами была проведена серия экспериментов по скринингу полученных путем спонтанной изменчивости морфоваров  и исходных родительских штаммов в лабораторных условиях. Оценивали также инсектицидную активность коллекционных штаммов и их морфоваров после хранения через определенные промежутки времени.

Результаты экспериментов по оценке исходных штаммов и морфоваров представлены в таблице 2.

Показано, что энтомоцидную активность проявляют все использованные в опыте культуры гриба. Наибольшая биологическая эффективность наблюдалась в варианте с обработкой гусениц суспензией спор морфовара р-72-1, гибель от которого составила 100% по сравнению с контролем. Самую низкую эффективность (35 %) показал морфовар р-72-2.

 Для штамма 85-69р и его морфологических вариантов более эффективными оказались морфоварианты 85-69р-1 и 85-69р-2, исходный штамм 85-69р уступал им на 15 и 16 % соответственно при титре 5х10⁷ КОЕ/г.

Смена тест – объекта от гусениц пчелиной огневки к личинкам колорадского жука не повлияла на полученные результаты показателя биологической эффективности, которые оказались сходными в обоих вариантах опыта. Так, при титре рабочей суспензии 1х10⁷ КОЕ/г наиболее вирулентным, как и в случае оценки на гусеницах пчелиной огневки, был морфовар р-72-1. Самая низкая эффективность, как и в предыдущем эксперименте, была у морфовара р-72-2 (20 %).  Аналогично ранее полученным данным, при титре 5х10⁷ КОЕ/мл наиболее эффективным оказался морфовар р-72-1 (98,7 %). Таким образом, наиболее активными против личинок колорадского жука оказались штамм р-72 и его морфологический вариант р-72-1. Это дало основание для использования M. аnisopliae в качестве агента контроля численности колорадского жука в полевых условиях.

Таблица 2. Биологическая эффективность исходных штаммов и морфологических вариантов M. аnisopliae в лабораторном опыте на 9-й день

Штаммы	Биологическая эффективность штаммов в лабораторном опыте, %
	гусеницы пчелиной огневки		личинки колорадского жука
	1х107, КОЕ/мл	5х107, КОЕ/мл	1х107, КОЕ/мл	5х107, КОЕ/мл
р-72	50	70	68	73
р-72-1	100	100	95	99
р-72-2	20	35	20	43
85-69р	50	75	64	79
85-69р-1	85	90	56	78
85-69р-2	70	89	55	71

Оценку биологической активности суспензий определяли также после хранения их при разных температурах как дополнительный критерий к определению жизнеспособности спор.

Результаты показали, что антиоксиданты ионол и тирозол в концентрации 0,15 % не только позволяют сохранить жизнеспособность конидий гриба в процессе хранения суспензии при комнатной (20 ⁰С) температуре, но и аналогичным образом предотвращают потерю биологической активности хранящейся культуры, не оказывая на нее негативного влияния. При температурах хранения -20  и 6  ⁰С  антиоксиданты ионол и тирозол не оказали положительного влияния на сохранение биологической активности, которая снизилась до нулевого значения после 5 месяцев хранения суспензии конидий при -20  ⁰С и после 9 месяцев хранения суспензии конидий при 6  ⁰С.

Биологическая активность культуры M. аnisopliae при хранении в сухом виде не зависела от добавления в нее антиоксиданта.

В связи с актуальностью сохранения биологической активности культуры гриба M. аnisopliae при хранении становится важным поиск решения, которое позволит быстро восстановить уровень вирулентности длительно хранящейся культуры до первоначального. Одним из таких методов является проведение пассажей штаммов энтомопатогена через организм восприимчивого насекомого – хозяина.

Проведенные нами исследования показали эффективность такого метода повышения биологической активности культуры в отношении штаммов р72 и 85-69р M. аnisopliae и их морфологических вариантов (табл. 3).

Таблица 3. Биологическая эффективность штаммов гриба M. anisopliae и их морфоваров после проведения пассажей на гусеницах G. mellonella в зависимости от титра конидий

Штамм	1 пассаж		2 пассаж		3 пассаж
	5x106	1x107	5x106	1x107	5x106	1x107
р-72	30	91	44	92	97	100
р-72-1	50	98	63	98	96	100
р-72-2	30	76	33	78	91	95
85-69р	23	93	57	93	86	98
85-69р-1	23	81	53	86	83	88
85-69р-2	15	83	46	88	80	90

Видно, что при пассажах происходит вытеснение неактивных клонов из популяции гриба, за счет чего численное значение вирулентности увеличивается при увеличении количества вирулентных клонов. Для увеличения вирулентности всех изученных штаммов их морфоваров достаточно было провести один пассаж через восприимчивое насекомое. Метод пассирования можно считать одним из эффективных и доступных для сохранения и увеличения вирулентности длительно хранящихся культур энтомопатогенных грибов, что подтверждено рядом авторов (Павлюшин, 1998; Огарков, Огаркова, 2000).

3. Полевые испытания

Биологический ресурс энтомопатогенного гриба M. аnisopliae позволяет считать его перспективной основой биологического препарата  для подавления численности колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. В настоящее время среди фитофагов, поражающих картофель, это наиболее вредоносный объект в России и в частности, в Сибири. Полученные в ходе лабораторных экспериментов данные достоверно указывают на эффективность некоторых штаммов культуры гриба M. аnisopliae против личинок этого вредителя. Это позволило осуществить отбор изолятов для дальнейшего проведения полевых опытов по изучению рационального использования биологического ресурса гриба M. аnisopliae в отношении колорадского жука, повреждающего картофель.

Учет заселенности растений картофеля личинками колорадского жука проводили в полевом эксперименте в сезоны 2005 – 2007 годов по фенологическим фазам растения: массовая бутонизация, массовое цветение, окончание цветения. Оценка велась путем подсчета количества личинок, не зависимо от возраста (Горбунов, Цветкова, 2001).  Для принятия решения о необходимости обработки растений использовали показатель экономического порога вредоносности, который составлял для перечисленных выше фаз 10, 15 и 20 % соответственно.

На рисунке 4 представлены средние данные по трем годам по оценке биологической эффективности природных и полученных селекционным путем штаммов энтомопатогенного гриба M. аnisopliae. В таблице 4 представлены  данные по урожайности картофеля (по годам и средние трехлетние) при его обработке против личинок колорадского жука.

Рисунок 4. Биологическая эффективность экспериментальных препаратов на основе гриба M. anisopliae (ЗАО “Шигаевское”, Новосибирская область, Сузунский район),  средние данные 2005 - 2007 гг.

Из рисунка 4 видно, что в условиях 100 % заселенности кустов картофеля личинками колорадского жука биологическая эффективность энтомопатогенных препаратов зависит от вирулентности штамма и титра спор, что подтверждает значимость селекции штаммов, направленной на отбор вариантов с повышенной вирулентностью. Соответственно, в связи с меньшей поврежденностью растений, урожайность во всех опытных вариантах превосходит урожайность в контроле (табл. 4).

Таблица 4.  Урожайность картофеля при его обработке против личинок колорадского жука

Штамм	Урожайность, т/га (2005 год)	Урожайность, т/га (2006 год)	Урожайность, т/га (2007 год)	Урожайность, т/га (средняя за три года)
Контроль	8,10	7,90	8,75	8,25
Р72	16,30	15,00	11,80	14,4
Р72-1	19,90	20,35	12,55	17,6
Р72-2	13,20	12,70	11,00	12,3
85-69	11,10	12,85	11,25	11,7
85-69-1	12,95	13,00	10,90	12,3
85-69-2	13,20	13,40	9,85	12,2
НСР05	2,90	4,70	1,20	2,90

Анализ трехлетних данных показал, что наибольшей биологической эффективностью обладает культура штамма р-72-1 энтомопатогенного гриба M. anisopliae. Для этого образца биологическая эффективность при максимальном титре спор в рабочей суспензии 5х10⁷ КОЕ/г составляла 85, 86 и 91 % соответственно для 2005, 2006 и 2007 гг.

Наиболее высокая урожайность картофеля также получена при обработке растений культурами штаммов р-72 и р-72-1 (табл. 4).

Данные полевых опытов подтвердили данные лабораторных экспериментов и доказали эффективность отбора вирулентных изолятов с целью дальнейшего их применения в качестве природного биологического ресурса для регуляции численности колорадского жука.

Выводы

1.     Выявлена гетерогенность популяций природных штаммов р-72 и 85 – 69р гриба Metarhizium anisopliae. Из изученных 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-69р  путем отбора  получены два морфологических варианта каждого природного штамма с пушистой и порошистой структурой колоний,  стабильных по культуральным и морфологическим свойствам при многократных пассажах на питательных средах. Установлены отличия по размеру (длине и ширине) конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Конидии морфовара р-72-1 достоверно превосходили конидии штаммов р-72 и р-72-2 по длине.

2.     Критериями отбора высоковирулентных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae из природных изолятов являлись показатели ферментативной активности и вирулентности гриба в отношении модельных насекомых (тест-объектов). Найдена высокая положительная корреляционная зависимость между ферментативной активностью и вирулентностью изученных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов (Р-72-1 и 2, 85 – 69р-1 и 2) (r =0,97 для хитиназы, 0,89 – для амилазы, 0,66 – для липазы, 0,92 – для эстеразы, 0,73 – для протеазы).

3.     Пассирование штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов через восприимчивое насекомое – хозяина позволяет увеличить вирулентность исходных штаммов и их морфоваров более, чем в два раза за три пассажа.

4.     Продолжительность хранения штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов зависит от температуры и препаративной формы. При  температуре 20 ⁰С сухая и жидкая биомасса могут храниться без потери биологической активности и жизнеспособности в течение 12 месяцев. При температуре 6 ⁰С жидкая и сухая формы сохраняют жизнеспособность в течение 12 месяцев, однако, жидкая биомасса к окончанию срока хранения снижает биологическую активность до нулевого значения. Выявлена положительная роль введения антиоксидантов ионола и тирозола при длительном хранении биомассы штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфоваров, которая проявляется в стабилизации количества живых спор и показателя биологической эффективности. При хранении суспензии спор гриба в условиях комнатной (20 ⁰С) температуры  наиболее эффективным для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне  в течение 12 месяцев оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30 %.

5.     Ультрафиолетовое облучение является наиболее сильным негативным фактором влияния на биоресурс гриба M. anisopliae, снижающим его жизнеспособность в модельном лабораторном эксперименте до нуля в течение 10 минут.  Наиболее устойчивым к действию ультрафиолетового света среди изученных штаммов и их морфологических вариантов оказался морфовар р-72-1, что может быть связано с пигментацией его конидий. Антиоксиданты, использованные для сохранения жизнеспособности спор в процессе длительного хранения, могут также служить протекторами от ультрафиолетового излучения для повышения биоресурса гриба.

6.     Среди изученных способов наработки спорово – мицелиальной массы гриба наиболее рациональным оказался способ культивирования на плотном стерильном растительном субстрате (разваренном пшене с добавлением отрубей). Такой метод культивирования важен для воспроизводства биологического ресурса  гриба M. anisopliae, поскольку позволяет получить биомассу, стабильную по количеству жизнеспособных конидий, которая может длительное время храниться без потери биологической активности.

7.     При оценке в лабораторных условиях все изучаемые штаммы и их морфовары проявляли энтомоцидную активность, при этом наибольшая биологическая активность отмечена для морфовара р-72-1, гибель тест-объектов (личинок колорадского жука) от которого составила 100 % по сравнению с контролем. Более низкая биологическая эффективность (70 %) получена для родительского штамма р-72.

8.     Обработка растений картофеля в фазу окончания бутонизации – начала массового цветения суспензией спор энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae обеспечивает снижение численности личинок колорадского жука на картофеле. Трехлетние полевые испытания показали его высокую биологическую эффективность (до 90 %). При этом  сохранность урожая средняя по трем годам составила 17,6 т/га (в 2,1 раза больше  по отношению к показателю урожайности в контроле).

9.     Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку – опасному вредителю картофеля, который может служить основой препарата для биологического контроля фитофага.

 Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.     Серебров В.В. Влияние энтомопатогенных грибов на активность детоксицирующих ферментов гусениц пчелиной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) и роль детоксицирующих ферментов при формировании резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам / В.В. Серебров, О.Н. Гербер, А.А. Малярчук, В.В. Мартемьянов, А.А. Алексеев, В.В.  Глупов // Изв. РАН. Сер. Биол. – 2006. - № 6. – с. 712 – 718.

2.     Малярчук А.А. Возможность использования энтомопатогенного гриба Меtarhizium anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук // Сиб. вестн. с.-х. науки. – 2007. - № 8. - с. 113 – 115.

3.     Крюков В.Ю. Перспективы использования энтомопатогенных гифомицетов (Deuteromycota, Hyphomycetes) против колорадского жука в условиях Юго – Восточного Казахстана / В.Ю. Крюков, В.В. Серебров, А.А. Малярчук, Б.К. Копжасаров, И.С. Мухамедиев, А.К. Орынбаева, В.П. Ходырев // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2007. - № 4. – с. 52 – 60.

4.     Штерншис М.В. Изучение энтомопатогенного гриба M. anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых – фитофагов / М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В. Гулий // Вестник Томского государственного университета. 2008. - №313.  – с. 232 – 236.

5.     Малярчук А.А. Оценка биологической эффективности экпериментальных препаратов на основе изолятов энтомопатогенного гриба M. anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук // Тезисы Международной научно-практич. конф. молодых ученых. Новосибирск, НГАУ, 2006. – с. 104.

6.     Maljarchuk A. Evaluation of M. anisopliae  morphotypes after UV-radiation and storage  / A. Maljarchuk, M. Shternshis, V. Gouli // 40th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 1st International forum on Entomopathogenic Nematodes and Symbiotic Bacteria, Quebec City - Universite Laval. Quebec, Canada.  - 2007. - p. 66.

7.     Serebrov V.V. Spontaneous Variability of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. Strains as an Approach for Enhancement of Insecticidal Activity / V.V. Serebrov, A.A. Maljarchuk, M.V. Shternshis // Plant Sci. (Sofia). 2007. v. 44. p. 236-238.

8.      Малярчук А.А. Оптимизация использования энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук, В.П. Цветкова, М.В. Штерншис // Биологическая защита растений – основа стабильности агроэкосистем.– Краснодар, 2008. - Вып. 5. – c. 306 – 309.

Подписано в печать 2009.

Тираж 100 экз. печ. л. 1,0. Заказ.

Опечатано в типографии НПФ

«Исследовательский центр».