2. Спорообразующие аэробные бактерии, используемые для получения пробиотиков
2.1. Биология аэробных спорообразующих бактерий
2.1.1 Морфология спорообразующих бактерий
Бактерии по внешнему виду подразделяют на 4 группы: шаровидные формы (кокки), палочковидные (бактерии, бациллы и клостридии), извитые (вибрионы, спириллы и спирохеты) и нитевидные (хламидобактерии). Бактерии, как правило, не образуют споры. Бациллы и клостридии преимущественно споры образуют.
Для нас большой интерес представляют бактерии рода Bacillus, которые благодаря способности к спорообразованию занимают особое место в микробном мире нашей планеты. В многочисленных публикациях нашли отражение теоретические и практические аспекты изучения аэробных спорообразующих бактерий, касающиеся вопросов морфологии и ультраструктуры этих микроорганизмов, процессов спорообразования и особенностей метаболизма, распространения в окружающей среде и функционирования в экстремальных условиях. В последние десятилетия описано большое количество антибиотических веществ, образуемых бактериями рода Bacillus, причем выделены антибиотики различной химической структуры и природы.
Аэробные спорообразующие бактерии объединены в отдельный род Bacillus семейства Bacillaceae. Для бацилл характерны палочковидная форма клеток, наличие эндоспор, образуемых в присутствии кислорода, высокая биологическая активность.
В последнее 20-летие ученые проявляют большой интерес к сенной палочке как к одному из перспективных микроорганизмов для производства пробиотических препаратов.
Сенная палочка (Bacillus subtilis) широко распространена в природе, имеет палочковидную форму. В присутствии кислорода образует споры, что позволяет ей длительный период сохраняться во внешней среде. Высокая биологическая активность является ее отличительной особенностью. Согласно данным литературных источников, сенная палочка имеет высокую изменчивость, что затрудняет ее идентификацию по культуральным свойствам. Так, у Bac. subtilis отмечается до 10 типов колоний при выращивании на различных агаризированных средах (Красильников, 1958).
Клетки бацилл обычно палочковидной формы с округлыми концами; располагаются одиночно, реже в виде цепочек. Поперечный размер вегетативных клеток 0,3- 2,2 мкм, длина 1,2- 7,0 мкм.
В клеточной стенке бацилл обнаружены тейхоевые кислоты, представляющие собой гетерополимеры глицерофосфата или рибитфосфата, сахара или его производного, d-аланина (Наумова, Никифорова, 1969). Тейхоевые кислоты Bac. subtilis в экспоненциальной фазе роста содержат до 30 % запаса фосфора клетки. Тейхоевые кислоты могут служить источником фосфора при его отсутствии во внешней среде (Grant, 1979). Тейхоевые кислоты обладают свойством связывать двухвалентные катионы.
Бактерии при определенных условиях роста могут образовывать формы, частично или полностью лишенные клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию (L-формы). L-формы Bac. licheniformis, Bac.subtilis не синтезируют пептидогликана, но усваивают его нуклеотидные предшественники. У L-форм этих бактерий повреждены системы синтеза ферментов, которые участвуют в образовании этих предшественников.
В клетках бацилл нуклеотиды расположены вдоль продольной оси клетки и локализованы в сферические, удлиненные или палочковидные компактные структуры. Перед делением шаровидный нуклеотид вытягивается, последовательно приобретая овальную, бобовидную, гантелевидную форму, с последующим делением путем перетяжки. Ядро состоит из линейной хромосомной ДНК. Вместе с тем в клетках многих штаммов бацилл обнаружена внехромосомная ковалентно замкнутая кольцевая ДНК, называемая плазмидной ДНК.
Генетическая роль плазмид изучена недостаточно. Многие авторы предполагают, что плазмиды участвуют в регуляции процессов спорогенеза и антибиотикообразования (Азизбекян, Галушко, 1977; Лукин, 1978; Ermakovaetal., 1978 и др.).
Размножаются бациллы путем деления клетки. Интенсивность роста и развития культур зависит от рационального соотношения минеральных и органических веществ в питательной среде.
Прокариотические организмы бактерий обладают способностью к спорообразованию, которая заключается в том, что при наступлении условий, неблагоприятных для жизни, клетка частично теряет воду, объём и форму; под внешней мембраной образуется плотная сферическая оболочка. В виде споры бактерия может выдерживать огромные механические, температурные и химические нагрузки. Например, некоторые споры выдерживают трёхчасовое кипячение или температуру жидкого азота. Также в виде споры более эффективно проходит расселение, потому что частично обезвоженная клетка имеет меньшую массу.
Споры бывают круглыми, овальными или эллиптическими; некоторые снабжены «рёбрами жёсткости», усиливающими устойчивость к механическим воздействиям. При микроскопическом исследовании споры выделяются высоким коэффициентом светопреломления, аналогичный таковому у обезвоженного белка.
В зрелой споре различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма), двухслойная ЦПМ и оболочка споры.
Спороплазма (протопласт споры) включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового синтеза и некоторые другие (например, анаэробного энергообразования).
Оболочка споры двухслойная: пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму. Внутренний слой (стен ка споры) образован пептидогликанами, аналогичными таковым \ вегетирующей клетки. Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью.
У некоторых бактерий материнская клетка образует экзоспориум — двух-трёхслойное желатинообразное покрытие образованное липопротеинами и углеводами и во многом аналогичное капсуле бактерий. При созревании споры экзоспориум может сохраняться в виде пустого и отстающего от споры «мешка».
Процесс споруляции (спорообразования) начинается сразу после возникновения дефицита питательных веществ и продолжается приблизительно 8 ч. Никаких внешних источников питания или энергии при этом не требуется. Споруляцию стимулирует внесение в среду глюкозы, фосфора и NH4; угнетает внесение пептона лактозы, NaCl, CaCl2 (у бактерий рода Bacillus— DL-аланина).
Споруляция контролируется особыми генами. Их число вариабельно у различных видов и может достигать 70. Для спорообразования важна индукция гена spoO. Его транскрипция запускает последовательную транскрипцию всех остальных необходимых генов (оперонов). Детали спорообразования служат видовыми признаками, но его принципиальные закономерности одинаковы для всех бактерий.
Подготовительная стадия споруляции сопровождается прекращением деления и увеличением количества липидных включений.
Стадия предспоры споруляции обычно начинается бурно. В клетке появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с изменёнными плотностью и тинкториальными свойствами. Подобное образование обозначают терминами «предспора», или «примордиальная спора».
Третья стадия споруляции включает появление оболочки (обычно в течение 10 мин после образования предспоры) и ещё большее увеличение коэффициента светопреломления.
Стадия созревания споры сопровождается её уплотнением и снижением метаболической активности клетки.
Споры могут располагаться центрально, субтерминально или терминально. У видов Bacillus диаметр споры не превышает ширины клетки, тогда как у многих видов Clostridium — значительно превышает. В ряде случаев клетка приобретает весьма характерный вид, нередко являющийся диагностическим признаком. Например, терминально расположенные споры у возбудителя столбняка придают бактериям вид «теннисных ракеток».
Поскольку споры сильно преломляют свет, то распознавание их при микроскопии не представляет затруднений. В спорных случаях прибегают к специальным методам окрашивания.
После созревания и лизиса родительской клетки спора освобождается, сохраняясь в покоящемся состоянии до попадания в благоприятные условия.
Некоторые из бацилл в процессе споруляции образуют бактериальные кристаллы. Многие белки которых токсичны являются эндотоксинами. Установлено, что содержание кристаллического вещества в клетках бацилл коррелирует с их вирулентностью (Kim, Li, 1976). Белок кристаллов по антигенным свойствам отличается от белка спор и клеток. Механизм действия эндотоксина основан на подавлении ацетилхолинэстеразы и нарушении транспорта ионов, что сопровождается параличом нервной системы насекомого (Prаsad, Shethna, 1976;Somervill, 1977).
В клетках бактерий Bacillussubtilis также обнаружены кристаллические структуры. По данным Kaneko и Matsushima (1973), у Bac. subtilis 168 кристаллоподобные структуры появляются на второй стадии споруляции и их формирование заканчивается в третей стадии, после чего клетки прекращают споруляцию и лизируются.
Процесс спорообразования зависит от источников питания. Бацилы активно образуют споры на пептонно - кукурузном агаре и разведенном МПБ (Глухова и соавт., 1975; Гашинский и соавт.,1975). На синтетических средах аэробные бациллы образуют мало спор.
Прорастание споры в оптимальных условиях осуществляется в течение 2-3 ч; процент проросших спор увеличивается после соответствующей предварительной обработки. Например, споры могут быть активированы кратковременным прогреванием.
Прорастанию предшествует активация споры. Её инициируют различные химические вещества, повышение температуры и влажности. Под воздействием автолизинов происходит расщепление кортекса, поглощение воды и набухание. Внешне процесс проявляется увеличением («вздутием») споры и уменьшением коэффициента светопреломления. При этом в споре происходят глубокие физиологические изменения: усиливается дыхание, увеличивается активность ферментов, происходит выделение аминокислот, дипиколиновой кислоты и пептидов (потеря сухой массы споры может достигать 20-30%). В этот период спора утрачивает терморезистентность.
Затем спора лопается в произвольном месте и из неё выходит вегетативная клетка, снабжённая у подвижных видов жгутиковым аппаратом.
